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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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sars37

捐助贵宾 (小有名气)

[求助] 转化后细菌提质粒,PCR条带很诡异

从板上挑的菌落都长的不是很好,基本上就只有几个菌落,挑完接种提质粒后PCR,发现条带只有100bp,目的基因有1000bp左右,而且还加了myc,为什么PCR之后就只有100bp了呢?
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xz2001199802

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
sars37(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你的更多精彩。 2013-07-22 20:08:33
为什么不先用colony PCR确认之后,再提质粒,质粒提了之后,浓度是多少,有可能浓度高了,建议稀释一定倍数后再来PCR。并建议在质粒提取后做酶切,这样也能判断目的基因是否插入,插入方向是否正确
越学越无知
2楼2013-07-22 19:58:03
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84146922

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
sars37: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-07-23 10:43:29
估计是引物二聚体
应该是假阳性
建议菌落PCR,才接种提质粒
3楼2013-07-22 20:48:52
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
sars37(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-07-22 21:06:43
sars37: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-07-23 10:43:21
一般来说,1kb左右的片段,连接正常转换正常的话,不应该只有几个点
结果告诉你连接不是很成功,重新做连接转化了
4楼2013-07-22 20:48:58
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
觉得是没有连上,重新酶切、连接、转化。
5楼2013-07-23 00:46:11
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sars37

捐助贵宾 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by lwiaanngg at 2013-07-22 20:48:58
一般来说,1kb左右的片段,连接正常转换正常的话,不应该只有几个点
结果告诉你连接不是很成功,重新做连接转化了

你好,这个实验已经重复几次了,每次涂板后长出的菌落都不是均匀分布在板上,是集中在边缘,菌落连在一起,然后我挑的是在边缘上独立出来的几个菌落。
6楼2013-07-23 10:41:52
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sars37

捐助贵宾 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 84146922 at 2013-07-22 20:48:52
估计是引物二聚体
应该是假阳性
建议菌落PCR,才接种提质粒

是把菌落划一半 另一半PCR吗?
7楼2013-07-23 10:43:00
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sars37

捐助贵宾 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-23 00:46:11
觉得是没有连上,重新酶切、连接、转化。

你好,我想请问我涂板后的菌落只是在边缘长出来,而且都连在一起,我是挑了几个独立出来的做,这种情况可能是什么问题呢?
8楼2013-07-23 11:43:21
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)

应该是空载
9楼2013-07-23 11:45:27
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84146922

金虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by sars37 at 2013-07-23 10:43:00
是把菌落划一半 另一半PCR吗?...

用牙签轻轻沾点去PCR就可以了
如果怕沾多了,可以先用牙签沾到加有5微升的无菌水的灭绝PCR管内
再吸0.5微升去进行PCR
10楼2013-07-23 12:51:50
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