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641306250

新虫 (初入文坛)

[求助] 做病毒检测，PCR跑胶500bp处总是有条带

我做病毒检测，本来目的条带是在200左右才对，但是琼脂糖凝胶电泳后500bp的地方总是有条带，重复N遍了，而且检测的不是一种病毒，图上这些孔一共检测了3种病毒，但是很诡异的500bp的地方总是有条带，而且加样越多条带越亮。PCR体系是25微升的，CDNA2微，引物正反向各0.5微，extaq0.2微，10倍buffer2.5微，dNTp2微，dd水17.3，之前一直用这个体系，都没问题，但是最近总是出这种问题。希望诸位高手给解释下。
做病毒检测，PCR跑胶500bp处总是有条带
433-Gel 2013-07-04 20hr 22min.jpg
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1楼 2013-07-04 20:43:22
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武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, Gifts of roses, there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-07-04 22:23:22
641306250: 金币+3, ★有帮助 2013-07-05 20:27:21
非特异扩增。建议：稀释模版。也就是模板少加点。稍微提高退火温度试试，减少非特异扩增。还有就是会不会是污染，引物，水，或者模板。，可以设置对照做一下

祝顺利
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2楼2013-07-04 21:33:16
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-05 15:05:44
建议加上一些control的样品，作一个小的DOE, 例如没有cDNA，看看是不是引物自身的问题
或者换一下buffer看看是不是TAE的问题
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3楼2013-07-05 08:25:17
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zhouking8758

木虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-05 15:05:56
没有阴性对照无法清楚的解释问题出在哪。
先用水做阴性对照，如何还出现这样的现象，就是你的引物或者其它试剂的问题。逐一更换寻找原因。
但是这样很费时间，还不如干脆重新换新的试剂
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4楼2013-07-05 10:25:02
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2981249

至尊木虫 (文坛精英)

木有

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人感觉是引物问题，楼主可以选取两个孔测一下序列，看看是不是你要扩增的病毒。。。
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帅是一种态度
5楼2013-07-05 11:02:43
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