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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于PCR，跑胶，求分析胶片
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fanwq258

木虫 (正式写手)

[交流] 关于PCR，跑胶，求分析胶片

这是这几天跑得胶，为什么一直有拖尾似的东西。而且以前可以跑出来的引物也有那样的拖尾似的东西，并且挺多的。求解惑啊！求指点啊！

Administrator 2012-12-27 22hr 49min.jpg



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1楼 2012-12-30 21:51:34
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郑顺利

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fanwq258: 金币+1 2013-01-01 13:06:10
fanwq258: 金币+7 2013-06-10 18:16:58
楼主，建议你用新的缓冲液和新洗干净的梳子试试，我以前也遇到过类似的现象，后来换了后就没出现了。
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9楼2012-12-31 09:33:59
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普通回帖

sj_wu

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fanwq258: 金币+1 2013-01-01 13:05:24
还算正常，只是没有主带，拖尾是其他能被EB染色的杂质，如蛋白、酶以及其他分子
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2楼2012-12-30 21:57:56
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fanwq258

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sj_wu at 2012-12-30 21:57:56
还算正常，只是没有主带，拖尾是其他能被EB染色的杂质，如蛋白、酶以及其他分子

，但是为什么每次都有拖尾呢？
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3楼2012-12-30 22:17:50
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fanwq258: 金币+1 2013-01-01 13:05:44
跑的是什么？PCR产物吗？感觉是样品不干净。marker不拖说明是样品问题。还有，你的胶的点样孔怎么那么亮啊。
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4楼2012-12-31 06:18:46
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fanwq258

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-31 06:18:46
跑的是什么？PCR产物吗？感觉是样品不干净。marker不拖说明是样品问题。还有，你的胶的点样孔怎么那么亮啊。

我是以cDNA为模板跑的PCR，点样孔亮，我不清楚了，一直都是这样的
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5楼2012-12-31 08:24:55
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fanwq258

木虫 (正式写手)
没人帮我吗？快来人啊
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6楼2012-12-31 08:25:25
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by fanwq258 at 2012-12-31 08:24:55
我是以cDNA为模板跑的PCR，点样孔亮，我不清楚了，一直都是这样的...

你有没有试试用不同浓度的模板P？
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7楼2012-12-31 09:19:59
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晓林寒风

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主，你做胶的梳子不干净吧，有DNA或者蛋白质残留吧。你cDNA做的文库么？
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8楼2012-12-31 09:30:25
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121however

铜虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fanwq258: 金币+1 2013-01-01 13:06:28
建议你在扫胶的时候调一下曝光，点样孔太亮了，另外你的样品可能有蛋白污染，在做个对照试试
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10楼2012-12-31 12:19:08
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静安jingan

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fanwq258: 金币+1 2013-01-01 13:06:45
其实我感觉是缓冲液的问题吧
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11楼2012-12-31 12:54:52
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fanwq258

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-31 09:19:59
你有没有试试用不同浓度的模板P？...

模板还可以不同吗？都是按试剂盒要求加的模板啊
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12楼2012-12-31 13:42:20
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fanwq258

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 晓林寒风 at 2012-12-31 09:30:25
楼主，你做胶的梳子不干净吧，有DNA或者蛋白质残留吧。你cDNA做的文库么？

梳子？每次做胶之前都是酒精擦拭干净的，然后TAE冲洗。模板是师兄提的RNA反转录出来的cDNA。
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13楼2012-12-31 13:47:00
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fanwq258

木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 静安jingan at 2012-12-31 12:54:52
其实我感觉是缓冲液的问题吧

你说的是电极缓冲液的问题吗？我是稀释的以前师兄配的母液，昨天还测了一下PH8.2，应该可以吧。
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14楼2012-12-31 13:54:14
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fanwq258

木虫 (正式写手)
marker看着还可以呀，缓冲液感觉应该没问题吧。
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15楼2012-12-31 13:58:03
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fanwq258

木虫 (正式写手)
求建议啊
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17楼2012-12-31 14:18:26
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foresthaust

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fanwq258: 金币+1 2013-01-01 13:07:29
楼主提供的几张图，主要是缺乏主带，或者是有主带但有拖尾；分析主要原因是PCR扩增不好，建议尝试将引物浓度稀释一倍或者尝试几个浓度，模板的添加量也做几个梯度。祝好！
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18楼2012-12-31 15:29:18
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1014805712

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
应该是非特异性扩增吧，所以有弥散的条带。
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19楼2012-12-31 15:43:33
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
12楼: Originally posted by fanwq258 at 2012-12-31 13:42:20
模板还可以不同吗？都是按试剂盒要求加的模板啊...

不同基因mRNA的丰度不同，反转录出来的cDNA量也是不一样的。PCR的时候要考虑这个问题吧。
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22楼2012-12-31 16:50:14
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fanwq258

木虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-31 16:50:14
不同基因mRNA的丰度不同，反转录出来的cDNA量也是不一样的。PCR的时候要考虑这个问题吧。...

我的cDNA浓度800多ng/ml，满足试剂盒的要求啊
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23楼2012-12-31 22:33:39
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
23楼: Originally posted by fanwq258 at 2012-12-31 22:33:39
我的cDNA浓度800多ng/ml，满足试剂盒的要求啊...

你PCR用的模板是双链cDNA吗？
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24楼2013-01-01 02:57:29
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xj0311

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
换一下引物，重新设计，另外胶的浓度调整一下
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25楼2013-01-01 09:55:33
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fanwq258

木虫 (正式写手)
引用回帖:
24楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-01 02:57:29
你PCR用的模板是双链cDNA吗？...

不是，是单链cDNA，有什么不一样吗？
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26楼2013-01-01 12:30:01
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fanwq258

木虫 (正式写手)
引用回帖:
25楼: Originally posted by xj0311 at 2013-01-01 09:55:33
换一下引物，重新设计，另外胶的浓度调整一下

我以前可以扩出来的引物，现在也扩不出来了，就算出来了，也只有一点，拖尾现象很重
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27楼2013-01-01 12:31:32
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fanwq258: 金币+1 2013-01-01 20:54:11
引用回帖:
26楼: Originally posted by fanwq258 at 2013-01-01 12:30:01
不是，是单链cDNA，有什么不一样吗？...

有区别的。合成单链cDNA的时候一般是不会去刻意把RNA模板消化掉，所以浓度很难确定。而且单链cDNA合成时候的量和所用引物以及模板的多少都有关系。双链cDNA合成的时候当第一条cDNA合成出来后消化掉了RNA模板，再形成双链，所以模板比较纯。
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28楼2013-01-01 15:31:23
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platanus

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fanwq258: 金币+1 2013-01-01 20:54:07
个人觉得第一：你的电泳液该换新的了；
        第二：你的样品出现非特异扩增，所以出现拖带，这个很正常的啦；
        第三：你的点样孔很亮表明点样孔里面有杂质。
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29楼2013-01-01 17:20:29
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贝壳v下了

铜虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fanwq258: 金币+1 2013-01-02 11:33:01
有可能是产生了引物二聚体的原因
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31楼2013-01-02 08:33:41
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Lester11

银虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fanwq258: 金币+1 2013-01-02 11:33:04
Marker选择的有点问题呀！样品条带不清晰，可能不纯或浓度过高
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32楼2013-01-02 08:55:13
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fanwq258

木虫 (正式写手)
引用回帖:
32楼: Originally posted by Lester11 at 2013-01-02 08:55:13
Marker选择的有点问题呀！样品条带不清晰，可能不纯或浓度过高

你的意思是模版不纯或浓度过高？
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34楼2013-01-02 12:14:31
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rainbow3311

铁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fanwq258: 金币+1 2013-01-02 14:22:42
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2013-01-02 17:12:23
是很奇怪，连标准条带的点样孔都发亮，说明楼主的点样孔有大片段的DNA组污染。楼主可以只做一个标准条带先看看点样孔是否发亮，如果不发亮，说明你的样品被大片段的DNA污染了；如果发亮，那就是楼主的操作上有问题，例如枪头、EB溶液被污染等。从图片上看，PCR产物不稳定，有很多非特异性扩增（引物设计不好导致）。楼主应该根据标准条带和目的产物的大小，先看看是否有目的产物扩增出来了。
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35楼2013-01-02 13:42:39
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fdzkfdzk1

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2013-01-02 17:12:35
fanwq258: 金币+1 2013-01-02 17:35:15
最近我做了核酸提取纯化然后反转录得到的cDNA,跑胶后点样孔周围并没有出现如上的亮斑。1.分析RNA质量，看是否有蛋白污染；2. 分析PCR模板，是否有降解；3. PCR体系进行分析，适当降低dNTP和Mg2+的浓度；4. 适当降低PCR循环。
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36楼2013-01-02 16:12:18
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Jathan

新虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fanwq258: 金币+1 2013-01-03 16:34:08
marker没有拖尾说明你的胶没有问题。但是你的样品都有拖尾，应该是你的样品有问题，可以在样品中加RNA酶后试一下，可能存在RNA或者DNA的残留导致拖尾
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37楼2013-01-03 13:41:11
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lyaikele

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
27楼: Originally posted by fanwq258 at 2013-01-01 12:31:32
我以前可以扩出来的引物，现在也扩不出来了，就算出来了，也只有一点，拖尾现象很重...

楼主，我最近也遇到你这种情况了，请问你的是怎么解决的啊？求交流！！
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38楼2013-05-19 19:41:37
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fanwq258

木虫 (正式写手)
引用回帖:
38楼: Originally posted by lyaikele at 2013-05-19 19:41:37
楼主，我最近也遇到你这种情况了，请问你的是怎么解决的啊？求交流！！...

我的就是没跑出来，都是引物二聚体，从新换引物了，可以跑出来了
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39楼2013-05-20 08:15:38
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denghengning

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
考虑引物和模板、、、、、
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40楼2013-05-20 22:57:00
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201022120316楼
2012-12-31 14:06   回复  
85319748620楼
2012-12-31 16:09   回复  
Dawang1621楼
2012-12-31 16:37   回复  
su-b0830楼
2013-01-02 00:46   回复  
goingabroad33楼
2013-01-02 09:42   回复  
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