应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 逆转录-pcr图，就解
231/3返回列表123下一页
查看: 2745  |  回复: 22
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)

[求助] 逆转录-pcr图，就解

最近在做反转录-PCR,结果是很奇怪啊，因此上传图片求高人指导：
    首先我的RNA是从细胞里提出来的。
    现在是做了反转录，并做了PCR ，跑胶结果让我很郁闷。
    反转录的体系是：
      DEPC水：1微升
      total RAN ：10微升（在小皿里种的细胞，浓度低，总量为0.98微克）
      oligodT:1微升（1微克）
      dNTPs：2微升
   PCR仪，70度，10分钟，后冰浴10MINS.
          然后离心，后加入5*AMV酶buffer ：4微
               RNasin：1微
               AMV:1微
           混匀，PCR 仪，42度，60mins；95度，10mins。
     然后做PCR.
        体系：
        2*PCR mix 10微
        上游引物：1微（10微摩/升）
        下游引物：1微（10微摩/升）
        cDNA:1微
         超纯水补足到20微。
   T=95度，3mins
     T=94度，1min
     T=58度，1min
     T=72度，4mins, 35个cycle。
   结果如图：
回复此楼

» 本帖附件资源列表

  • 欢迎监督和反馈：小木虫仅提供交流平台，不对该内容负责。
    本内容由用户自主发布，如果其内容涉及到知识产权问题，其责任在于用户本人，如对版权有异议，请联系邮箱：xiaomuchong@tal.com
  • 附件 1 : pcr.tif
    • 2012-09-26 19:16:45, 1.53 M

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-09-26 19:16:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)
补充啊：第一个泳道是内参（540bp），其余的泳道是我要P的东西，大小是739bp，可什么都没，求解啊
赞一下 回复此楼
2楼2012-09-26 19:19:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-09-27 14:05:46
首先你确定你的RNA没问题？不知道你提的是总RNA还是mRNA。如果是总RNA可以跑个电泳看看rRNA的情况。可能是你的目的基因丰度低，反转录的时候加入你的目的基因特异3’引物。
此外，我对你的实验设计有几点建议。你的目的片段不应该设计过长。RT-PCR的扩增片段在200bp左右，一般不要超过500bp。大片段扩增会降低扩增效率。PCR时的变性、退火、延伸都偏长，尤其是延伸，再怎么说也不用4分钟吧。
赞一下 回复此楼
3楼2012-09-27 07:56:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

494750284

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-27 14:05:55
可能问题
1、RNA提取完之后是否检测过其质量：nanodrop+电泳图
2、RNA提取过程中是否有RNase污染？如果有可能在你逆转录过程中就。。。
3、各试剂是不是有问题？我的意思是酶是否失活。实验室其他人使用是否有问题？如果别人做的没错，那就是你操作有问题
4、同意楼上，PCR程序，时间太夸张。建议看看PCR原理，Taq酶3kb/min吧，记不太清了，总之差不多。你设置4min木有必要吧。其他时间就不说了
赞一下 回复此楼
4楼2012-09-27 13:18:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

panman89

金虫 (小有名气)
用oligodt为引物只能反转有poly-A的RNA，
赞一下 回复此楼
5楼2012-09-27 13:40:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-09-27 07:56:36
首先你确定你的RNA没问题？不知道你提的是总RNA还是mRNA。如果是总RNA可以跑个电泳看看rRNA的情况。可能是你的目的基因丰度低，反转录的时候加入你的目的基因特异3’引物。
此外，我对你的实验设计有几点建议。你的 ...

我提的是总RNA ,跑出来三条带都很清楚，我现在延伸的温度是一分钟。
今天做了个退火温度的梯度分析，从49度到60度，但还是什么都P不出来。
赞一下 回复此楼
6楼2012-09-27 13:59:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 494750284 at 2012-09-27 13:18:28
可能问题
1、RNA提取完之后是否检测过其质量：nanodrop+电泳图
2、RNA提取过程中是否有RNase污染？如果有可能在你逆转录过程中就。。。
3、各试剂是不是有问题？我的意思是酶是否失活。实验室其他人使用是否有问 ...

RNA我也用电泳图检测过了，没有问题，也无污染。
现在程序已经变了， T=94度，3mins
     T=94度，45s
     T=49-60度，45s     T=72度，45s, 40个cycle。
   结果还是什么都P不出来
赞一下 回复此楼
7楼2012-09-27 14:04:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)
现在我的PCR体系已经换了，T=94度，3mins
     T=94度，45s
     T=49-60度，45s     
    T=72度，45s, 40个cycle
    最后在延伸72度，10mins。 可结果依旧啊 ，我真哭
赞一下 回复此楼
8楼2012-09-27 14:08:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-28 14:33:10
你有没有测试目的基因的引物。比如用基因组DNA做模板，能不能正常P出，顺便可以优化下PCR退火温度。如果引物没问题的话，你又可以跑出内参，只能是丰度问题了。你的RNA是否反复冻融？是不是提好后马上做的反转录？目的基因的mRNA半衰期很短吗？做RT时候适当增加模板用量。如果实在不行，就加入用3’基因特异引物做反转录。
赞一下 回复此楼
9楼2012-09-27 14:35:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

494750284

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-28 14:33:20
额，如果RNA正常。那就排除一个原因。
那这样吧，你用你反转的cDNA为模板，用你已有的确定的引物P一下其他目的基因。比如你现在P大鼠的GAPDH没P出来，没办法确定是反转体系有问题还是引物有问题，那用你确定能P出来的β-actin，要是这么也P不出来，那问题就是反转体系。P不出来，我觉得应该是引物有问题
赞一下 回复此楼
10楼2012-09-27 20:25:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 xingfuxiaoyu 的主题更新
231/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料调剂 +7 18815505510 2026-04-09 8/400 2026-04-09 10:46 by 2006600301
[考研] 0854调剂 +5 长弓傲 2026-04-09 5/250 2026-04-09 10:14 by wp06
[考研] 0703调剂 +17 拾玖壹 2026-04-04 19/950 2026-04-09 09:18 by may_新宇
[考研] 材料类284调剂 +23 想换手机不想解� 2026-04-08 27/1350 2026-04-09 08:40 by byk122723822
[考研] 调剂 +10 月@163.com 2026-04-08 10/500 2026-04-09 08:38 by 5268321
[考研] 一志愿电子科技大学085600材料与化工 329分求调剂 +11 Naiko 2026-04-04 11/550 2026-04-08 14:00 by wutongshun
[考研] 284求调剂 +17 梵@@ 2026-04-06 17/850 2026-04-08 11:35 by 1shin_ichi
[考研] 求考研材料调剂 +3 材化李可 2026-04-07 3/150 2026-04-08 00:21 by JourneyLucky
[考研] 315求调剂 +3 TUZEIQAQ 2026-04-02 3/150 2026-04-07 17:32 by chenp123
[硕博家园] 0856材料化工求调剂，一志愿211，初试成绩349 +4 江淮北月 2026-04-05 4/200 2026-04-06 22:44 by chenzhimin
[考研] 22408 331分求调剂 +4 y__1 2026-04-06 4/200 2026-04-06 17:26 by 土木硕士招生
[考研] 285求调剂 +8 AZMK 2026-04-04 11/550 2026-04-06 13:56 by BruceLiu320
[考研] 生物学求调剂 +5 15064154688 2026-04-03 5/250 2026-04-06 11:56 by lijunpoly
[考研] 327求调剂 +4 拾光任染 2026-04-05 4/200 2026-04-05 20:16 by 南航~万老师
[考研] 085602调剂 初试总分335 +12 19123253302 2026-04-04 12/600 2026-04-05 08:08 by 544594351
[考研] 283分求调剂 +7 小聂爱学习 2026-04-03 7/350 2026-04-04 21:51 by hemengdong
[考研] 341求调剂 +3 洛多罗 2026-04-02 4/200 2026-04-04 21:36 by 智能智慧
[考研] 数二英二348求调剂 +4 hxdzj1 2026-04-03 5/250 2026-04-03 21:25 by zhq0425
[考研] 260求调剂 +6 朱芷琳 2026-04-02 6/300 2026-04-02 20:27 by 6781022
[考研] 22408 266求调剂 +3 masss11222 2026-04-02 3/150 2026-04-02 18:11 by 笔落锦州
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭