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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 494750284 at 2012-09-27 20:25:23
额,如果RNA正常。那就排除一个原因。
那这样吧,你用你反转的cDNA为模板,用你已有的确定的引物P一下其他目的基因。比如你现在P大鼠的GAPDH没P出来,没办法确定是反转体系有问题还是引物有问题,那用你确定能P出来 ...

我现在用我反转录的CDNA 能P 出来β-actin,这说明我的CDNA 是没有问题的,但就是P 不出来我的目的片段,现在不知道是体系的问题还是引物的问题,体系我已经在变了今天做了退火温度梯度,但还是出不来,我现在增大了模版量试试
11楼2012-09-27 20:40:51
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494750284

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-09-28 14:33:40
如果这样的话,果断的换引物,如果你已经做了梯度还是没出来,说明引物质量很差。比较省事儿的方法是去文献找现成的,自己验证一下。自己设计的话就一次多设计几个,多花一二百引物钱,但是可能会节约时间
12楼2012-09-27 21:50:43
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wxd729

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-09-28 14:33:49
1.首先你用核酸液直接跑胶一下,证实一下你提取的核酸液的纯度和3个片段的情况。2. 用oligodt为引物只能反转有poly-A的RNA,一般情况下只要有核酸存在都能扩增的出来。
13楼2012-09-28 05:53:15
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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
12楼: Originally posted by 494750284 at 2012-09-27 21:50:43
如果这样的话,果断的换引物,如果你已经做了梯度还是没出来,说明引物质量很差。比较省事儿的方法是去文献找现成的,自己验证一下。自己设计的话就一次多设计几个,多花一二百引物钱,但是可能会节约时间

我做了退火温度梯度,也做了模板浓度梯度,可还是出不来啊,我急死了
14楼2012-09-29 10:26:04
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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
13楼: Originally posted by wxd729 at 2012-09-28 05:53:15
1.首先你用核酸液直接跑胶一下,证实一下你提取的核酸液的纯度和3个片段的情况。2. 用oligodt为引物只能反转有poly-A的RNA,一般情况下只要有核酸存在都能扩增的出来。

提的RNA 我已经跑过胶了,三条带很明显,可怎么都出不来,难道人不行?
15楼2012-09-29 10:27:38
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494750284

木虫 (小有名气)

引用回帖:
14楼: Originally posted by xingfuxiaoyu at 2012-09-29 10:26:04
我做了退火温度梯度,也做了模板浓度梯度,可还是出不来啊,我急死了...

我不是让你摸索反应条件,这可能是你的引物根本就不行。引物不合格很正常啊,你为啥那么确定你设计的引物没问题呢?文献报道?
16楼2012-09-29 13:44:53
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baby1987

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
换个以前可以p出来的引物试试,如果还p不出来,可能就是反转录出问题了。
加油。
17楼2012-09-29 15:31:29
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wxd729

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

这是你用的引物序列有问题,请重新设计引物
18楼2012-09-29 20:32:29
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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
16楼: Originally posted by 494750284 at 2012-09-29 13:44:53
我不是让你摸索反应条件,这可能是你的引物根本就不行。引物不合格很正常啊,你为啥那么确定你设计的引物没问题呢?文献报道?...

当时是自己设计的,老师也看过了,这下真是确定出问题了,谢谢你啊
19楼2012-10-05 16:09:17
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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
17楼: Originally posted by baby1987 at 2012-09-29 15:31:29
换个以前可以p出来的引物试试,如果还p不出来,可能就是反转录出问题了。

用别的引物都可以P出来,就是我的目的片段P不出来,现在觉得是引物的问题了
20楼2012-10-05 16:10:00
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