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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)

[求助] 逆转录-pcr图,就解

最近在做反转录-PCR,结果是很奇怪啊,因此上传图片求高人指导:
    首先我的RNA是从细胞里提出来的。
    现在是做了反转录,并做了PCR ,跑胶结果让我很郁闷。
    反转录的体系是:
      DEPC水:1微升
      total RAN :10微升(在小皿里种的细胞,浓度低,总量为0.98微克)
      oligodT:1微升(1微克)
      dNTPs:2微升
   PCR仪,70度,10分钟,后冰浴10MINS.
          然后离心,后加入5*AMV酶buffer :4微
               RNasin:1微
               AMV:1微
           混匀,PCR 仪,42度,60mins;95度,10mins。
     然后做PCR.
        体系:
        2*PCR mix 10微
        上游引物:1微(10微摩/升)
        下游引物:1微(10微摩/升)
        cDNA:1微
         超纯水补足到20微。
   T=95度,3mins
     T=94度,1min
     T=58度,1min
     T=72度,4mins, 35个cycle。
   结果如图:
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  • 2012-09-26 19:16:45, 1.53 M

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494750284

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-27 14:05:55
可能问题
1、RNA提取完之后是否检测过其质量:nanodrop+电泳图
2、RNA提取过程中是否有RNase污染?如果有可能在你逆转录过程中就。。。
3、各试剂是不是有问题?我的意思是酶是否失活。实验室其他人使用是否有问题?如果别人做的没错,那就是你操作有问题
4、同意楼上,PCR程序,时间太夸张。建议看看PCR原理,Taq酶3kb/min吧,记不太清了,总之差不多。你设置4min木有必要吧。其他时间就不说了
4楼2012-09-27 13:18:28
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查看全部 23 个回答

xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)

补充啊:第一个泳道是内参(540bp),其余的泳道是我要P的东西,大小是739bp,可什么都没,求解啊
2楼2012-09-26 19:19:48
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-09-27 14:05:46
首先你确定你的RNA没问题?不知道你提的是总RNA还是mRNA。如果是总RNA可以跑个电泳看看rRNA的情况。可能是你的目的基因丰度低,反转录的时候加入你的目的基因特异3’引物。
此外,我对你的实验设计有几点建议。你的目的片段不应该设计过长。RT-PCR的扩增片段在200bp左右,一般不要超过500bp。大片段扩增会降低扩增效率。PCR时的变性、退火、延伸都偏长,尤其是延伸,再怎么说也不用4分钟吧。
3楼2012-09-27 07:56:36
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panman89

金虫 (小有名气)

用oligodt为引物只能反转有poly-A的RNA,
5楼2012-09-27 13:40:33
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