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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 逆转录-pcr图，就解
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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)

[求助] 逆转录-pcr图，就解

最近在做反转录-PCR,结果是很奇怪啊，因此上传图片求高人指导：
    首先我的RNA是从细胞里提出来的。
    现在是做了反转录，并做了PCR ，跑胶结果让我很郁闷。
    反转录的体系是：
      DEPC水：1微升
      total RAN ：10微升（在小皿里种的细胞，浓度低，总量为0.98微克）
      oligodT:1微升（1微克）
      dNTPs：2微升
   PCR仪，70度，10分钟，后冰浴10MINS.
          然后离心，后加入5*AMV酶buffer ：4微
               RNasin：1微
               AMV:1微
           混匀，PCR 仪，42度，60mins；95度，10mins。
     然后做PCR.
        体系：
        2*PCR mix 10微
        上游引物：1微（10微摩/升）
        下游引物：1微（10微摩/升）
        cDNA:1微
         超纯水补足到20微。
   T=95度，3mins
     T=94度，1min
     T=58度，1min
     T=72度，4mins, 35个cycle。
   结果如图：
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    • 2012-09-26 19:16:45, 1.53 M

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1楼 2012-09-26 19:16:45
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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)
补充啊：第一个泳道是内参（540bp），其余的泳道是我要P的东西，大小是739bp，可什么都没，求解啊
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2楼2012-09-26 19:19:48
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-09-27 14:05:46
首先你确定你的RNA没问题？不知道你提的是总RNA还是mRNA。如果是总RNA可以跑个电泳看看rRNA的情况。可能是你的目的基因丰度低，反转录的时候加入你的目的基因特异3’引物。
此外，我对你的实验设计有几点建议。你的目的片段不应该设计过长。RT-PCR的扩增片段在200bp左右，一般不要超过500bp。大片段扩增会降低扩增效率。PCR时的变性、退火、延伸都偏长，尤其是延伸，再怎么说也不用4分钟吧。
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3楼2012-09-27 07:56:36
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494750284

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-27 14:05:55
可能问题
1、RNA提取完之后是否检测过其质量：nanodrop+电泳图
2、RNA提取过程中是否有RNase污染？如果有可能在你逆转录过程中就。。。
3、各试剂是不是有问题？我的意思是酶是否失活。实验室其他人使用是否有问题？如果别人做的没错，那就是你操作有问题
4、同意楼上，PCR程序，时间太夸张。建议看看PCR原理，Taq酶3kb/min吧，记不太清了，总之差不多。你设置4min木有必要吧。其他时间就不说了
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4楼2012-09-27 13:18:28
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panman89

金虫 (小有名气)
用oligodt为引物只能反转有poly-A的RNA，
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5楼2012-09-27 13:40:33
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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-09-27 07:56:36
首先你确定你的RNA没问题？不知道你提的是总RNA还是mRNA。如果是总RNA可以跑个电泳看看rRNA的情况。可能是你的目的基因丰度低，反转录的时候加入你的目的基因特异3’引物。
此外，我对你的实验设计有几点建议。你的 ...

我提的是总RNA ,跑出来三条带都很清楚，我现在延伸的温度是一分钟。
今天做了个退火温度的梯度分析，从49度到60度，但还是什么都P不出来。
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6楼2012-09-27 13:59:27
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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 494750284 at 2012-09-27 13:18:28
可能问题
1、RNA提取完之后是否检测过其质量：nanodrop+电泳图
2、RNA提取过程中是否有RNase污染？如果有可能在你逆转录过程中就。。。
3、各试剂是不是有问题？我的意思是酶是否失活。实验室其他人使用是否有问 ...

RNA我也用电泳图检测过了，没有问题，也无污染。
现在程序已经变了， T=94度，3mins
     T=94度，45s
     T=49-60度，45s     T=72度，45s, 40个cycle。
   结果还是什么都P不出来
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7楼2012-09-27 14:04:06
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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)
现在我的PCR体系已经换了，T=94度，3mins
     T=94度，45s
     T=49-60度，45s     
    T=72度，45s, 40个cycle
    最后在延伸72度，10mins。 可结果依旧啊 ，我真哭
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8楼2012-09-27 14:08:33
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-28 14:33:10
你有没有测试目的基因的引物。比如用基因组DNA做模板，能不能正常P出，顺便可以优化下PCR退火温度。如果引物没问题的话，你又可以跑出内参，只能是丰度问题了。你的RNA是否反复冻融？是不是提好后马上做的反转录？目的基因的mRNA半衰期很短吗？做RT时候适当增加模板用量。如果实在不行，就加入用3’基因特异引物做反转录。
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9楼2012-09-27 14:35:54
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494750284

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-28 14:33:20
额，如果RNA正常。那就排除一个原因。
那这样吧，你用你反转的cDNA为模板，用你已有的确定的引物P一下其他目的基因。比如你现在P大鼠的GAPDH没P出来，没办法确定是反转体系有问题还是引物有问题，那用你确定能P出来的β-actin，要是这么也P不出来，那问题就是反转体系。P不出来，我觉得应该是引物有问题
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10楼2012-09-27 20:25:23
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