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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 转化后细菌提质粒，PCR条带很诡异
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sars37

捐助贵宾 (小有名气)

[求助] 转化后细菌提质粒，PCR条带很诡异

从板上挑的菌落都长的不是很好，基本上就只有几个菌落，挑完接种提质粒后PCR，发现条带只有100bp，目的基因有1000bp左右，而且还加了myc，为什么PCR之后就只有100bp了呢？
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1楼 2013-07-22 17:26:10
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

xz2001199802

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
sars37(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩。 2013-07-22 20:08:33
为什么不先用colony PCR确认之后，再提质粒，质粒提了之后，浓度是多少，有可能浓度高了，建议稀释一定倍数后再来PCR。并建议在质粒提取后做酶切，这样也能判断目的基因是否插入，插入方向是否正确
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越学越无知
2楼2013-07-22 19:58:03
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84146922

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sars37: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-07-23 10:43:29
估计是引物二聚体
应该是假阳性
建议菌落PCR，才接种提质粒
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3楼2013-07-22 20:48:52
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sars37(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-22 21:06:43
sars37: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-07-23 10:43:21
一般来说，1kb左右的片段，连接正常转换正常的话，不应该只有几个点
结果告诉你连接不是很成功，重新做连接转化了
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4楼2013-07-22 20:48:58
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
觉得是没有连上，重新酶切、连接、转化。
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5楼2013-07-23 00:46:11
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sars37

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lwiaanngg at 2013-07-22 20:48:58
一般来说，1kb左右的片段，连接正常转换正常的话，不应该只有几个点
结果告诉你连接不是很成功，重新做连接转化了

你好，这个实验已经重复几次了，每次涂板后长出的菌落都不是均匀分布在板上，是集中在边缘，菌落连在一起，然后我挑的是在边缘上独立出来的几个菌落。
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6楼2013-07-23 10:41:52
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sars37

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 84146922 at 2013-07-22 20:48:52
估计是引物二聚体
应该是假阳性
建议菌落PCR，才接种提质粒

是把菌落划一半 另一半PCR吗？
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7楼2013-07-23 10:43:00
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sars37

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-23 00:46:11
觉得是没有连上，重新酶切、连接、转化。

你好，我想请问我涂板后的菌落只是在边缘长出来，而且都连在一起，我是挑了几个独立出来的做，这种情况可能是什么问题呢？
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8楼2013-07-23 11:43:21
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)
应该是空载
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9楼2013-07-23 11:45:27
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84146922

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by sars37 at 2013-07-23 10:43:00
是把菌落划一半 另一半PCR吗？...

用牙签轻轻沾点去PCR就可以了
如果怕沾多了，可以先用牙签沾到加有5微升的无菌水的灭绝PCR管内
再吸0.5微升去进行PCR
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10楼2013-07-23 12:51:50
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