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转化后菌液PCR鉴定，没有目的条带
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PCR时得到目的片段800bp，亮且单一，可是连接转化后，再菌液PCR鉴定，却始终只有200bp左右的条带，是怎么回事啊？有两次菌液鉴定得到800bp的单一亮条带，可是将测序结果提交到NCBI比对，却是没有找到相似序列？为什么就是转化不出目的序列呢？哪位大侠路过，请帮忙解答，谢谢！ （载体为PUCm-T Vecter；宿主为E.coli 5a） （菌液鉴定：M13通用引物） 实验均按照生工生物T-载体PCR产物克隆试剂盒上规定操作 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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chenguestc
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【答案】应助回帖
1949stone: 回帖置顶 2012-08-31 07:24:17
1949stone: MolEPI+1, 应助指数+1, 很好 很充分 2012-08-31 07:24:42
1949stone: MolEPI+1, 应助指数+1, 很好 很充分 2012-08-31 07:24:42
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如果分子量都不对，那我觉得是从最开始找问题应该，每一步都CHECK一下。 PCR之后，跑胶，请加MARKER标定PCR产物分子量。 回收之后，请把回收产物用2-3微升跑胶，看分子量是否正确。 如果正确，连接转化。 转化后涂平板，培养，挑取单克隆。 单克隆菌液同时用通用引物及你的特异引物做PCR验证分子量是否正确。 如果正确就大量培养，提取质粒测序。 如果你们自己有测序仪，可以用纯化的PCR产物来测序，前提是分子量是正确的话。 |
9楼2012-08-31 06:53:28
12楼2012-09-02 16:06:03
2楼2012-08-30 09:58:02
gwd0312
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10楼2012-08-31 09:05:47
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