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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 转化后菌液PCR鉴定，没有目的条带
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hzxm0316

铁虫 (初入文坛)

[求助] 转化后菌液PCR鉴定，没有目的条带

PCR时得到目的片段800bp，亮且单一，可是连接转化后，再菌液PCR鉴定，却始终只有200bp左右的条带，是怎么回事啊？有两次菌液鉴定得到800bp的单一亮条带，可是将测序结果提交到NCBI比对，却是没有找到相似序列？为什么就是转化不出目的序列呢？哪位大侠路过，请帮忙解答，谢谢！

（载体为PUCm-T Vecter；宿主为E.coli 5a）
（菌液鉴定：M13通用引物）
  实验均按照生工生物T-载体PCR产物克隆试剂盒上规定操作
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1楼2012-08-29 16:56:32
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回帖置顶 ( 共有1个 )

chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

1949stone: 回帖置顶 2012-08-31 07:24:17
1949stone: MolEPI+1, 应助指数+1, 很好 很充分 2012-08-31 07:24:42
如果分子量都不对，那我觉得是从最开始找问题应该，每一步都CHECK一下。
PCR之后，跑胶，请加MARKER标定PCR产物分子量。
回收之后，请把回收产物用2-3微升跑胶，看分子量是否正确。
如果正确，连接转化。
转化后涂平板，培养，挑取单克隆。
单克隆菌液同时用通用引物及你的特异引物做PCR验证分子量是否正确。
如果正确就大量培养，提取质粒测序。
如果你们自己有测序仪，可以用纯化的PCR产物来测序，前提是分子量是正确的话。
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9楼2012-08-31 06:53:28
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

hzxm0316

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-31 06:53:28
如果分子量都不对，那我觉得是从最开始找问题应该，每一步都CHECK一下。
PCR之后，跑胶，请加MARKER标定PCR产物分子量。
回收之后，请把回收产物用2-3微升跑胶，看分子量是否正确。
如果正确，连接转化。
转化后 ...

谢谢，你的实验态度很谨慎，值得学习！可是我觉得不是分子量的问题，最后得到的200bp可能是引物二聚体，也就是说目的片段丢失，没有克隆出来
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12楼2012-09-02 16:06:03
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普通回帖

王礼鹏

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 同意 2012-08-31 07:23:55
会不会你挑的菌是假阳性的呀，多挑几个试试，或酶切看看
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2楼2012-08-30 09:58:02
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 同意 2012-08-31 07:23:22
PCR很可能扩增得到有条带的假阳性克隆，你P的同时最好做个酶切验证，验证结果一致的再测序，这样是你需要的东东的可能性就更大！
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持之以恒、永不放弃！
3楼2012-08-30 10:14:59
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装子516

铁虫 (初入文坛)
学习学习
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4楼2012-08-30 10:38:37
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-30 14:47:26
如果你测序后获得800bp，但是比对没有同源性序列，说明是一个新序列。
如果测序结果只有200，只能说明你连接上的片段不对，或者是假阳性。最好，菌落PCR验证时，用通用引物和你自己的特异引物同时扩增来验证。
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5楼2012-08-30 13:12:12
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hzxm0316

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-30 13:12:12
如果你测序后获得800bp，但是比对没有同源性序列，说明是一个新序列。
如果测序结果只有200，只能说明你连接上的片段不对，或者是假阳性。最好，菌落PCR验证时，用通用引物和你自己的特异引物同时扩增来验证。

测序结果是320bp，核苷酸比对没有找到同源序列。但是比对EST时，却找到同源EST,这可以说明该基因是有表达的吗？但是我该如何再获得目的基因呢？谢谢
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6楼2012-08-30 16:27:31
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hzxm0316

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 王礼鹏 at 2012-08-30 09:58:02
会不会你挑的菌是假阳性的呀，多挑几个试试，或酶切看看

蓝白斑平板，白斑约有70%，已经重复试验了几次，不过感觉很多菌斑若蓝若白？可是尽量挑的白斑的呀
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7楼2012-08-30 16:33:15
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hzxm0316

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gwd0312 at 2012-08-30 10:14:59
PCR很可能扩增得到有条带的假阳性克隆，你P的同时最好做个酶切验证，验证结果一致的再测序，这样是你需要的东东的可能性就更大！

请问：“PCR扩增得到有条带的假阳性克隆”是什么意思啊？
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8楼2012-08-30 16:34:15
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xiongyaoling

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先得确定你的目的条带连上了吗？菌落PCR没有结果，可能是酶切和连接上出上问题。扩增得到200bp，这应该是引物二聚体吧。
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10楼2012-08-31 09:05:47
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