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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求PCR解！谢谢！
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wzc4884

金虫 (正式写手)

[求助] 求PCR解！谢谢！

大家好，求解PCR，希望大家指点一下。附件是我今天做的PCR结果。泳道14是阴性PCR对照即模板是2微升二次水，泳道11、12是阳性PCR结果，泳道2至10是待检验的菌液，（其中菌液是从构建的重组质粒中转化BL21DE3后，挑取单克隆摇起的菌液，直接加2微升菌液进行的PCR）。请大家帮助分析下，是否是阳性结果呢？还是根本就是假阳性的单克隆呢？谢谢了！
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1楼2011-04-28 15:50:14
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
1949stone(金币+1): 鼓励 2011-04-28 19:03:10
1有可能是对的，其他的大小和你阳性有差别，建议1提质粒酶切验证
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在等待中涅槃重生
2楼2011-04-28 16:16:01
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

wzc4884(金币+1): 谢谢！ 2011-04-28 16:35:36
说错了，是第二道可能是对的
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在等待中涅槃重生
3楼2011-04-28 16:16:38
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
Originally posted by wzc4884 at 2011-04-28 15:50:14:
大家好，求解PCR，希望大家指点一下。附件是我今天做的PCR结果。泳道14是阴性PCR对照即模板是2微升二次水，泳道11、12是阳性PCR结果，泳道2至10是待检验的菌液，（其中菌液是从构建的重组质粒中转化BL21DE3后，挑 ...

我也举得泳道2（maker右边第一个）是对的。可以提质粒，跟载体一起跑胶，跑久点，如果是重组质粒，会比载体跑得慢，从胶上可以看出来。之后再酶切最后验证。
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4楼2011-04-28 16:19:13
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475502411

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
1949stone(金币+1): 鼓励 2011-04-28 19:03:25
做下酶切鉴定和测序吧
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
5楼2011-04-28 16:20:08
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4, EPI+1): 鼓励~ 2011-04-28 16:49:59
首先楼主你是想干什么？以后求助的时候一定得说清楚你想干什么？反正从你的帖子我没有很明确看出来你想干什么？
我猜：你是想验证你的基因是不是已经连接上了，然后就用菌液来进行PCR？如果正如我所说，我的建议如下：
1：泳道2有可能是对的，但是为神马这么模糊，你的对照都这么亮？
2：其它泳道不排除连上的概率，可以再进行一次PCR验证，体系得改改啊。。。
3：可以将有可能对的菌液提取质粒进行PCR（质粒当模板）；或者酶切验证。

PS:说说对于一般连接验证的步骤:
1:可以用菌液，也可以将菌划到板子上，我们常用后者；然后用菌液当模板进行PCR，结果会显示哪一个菌能够P出目的条带；
2：将疑似正确的菌提取质粒，跑电泳，点上空质粒作为对照，如果连上的话一般重组质粒会稍微大一些；
3：酶切质粒，电泳验证，记得点上酶切的基因和酶切的质粒进行对照。。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
6楼2011-04-28 16:32:09
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wzc4884

金虫 (正式写手)
谢谢大家的帮助，正如您所说的，我确实像验证是否连接成功，呵呵。2号泳道是我从BL21DE3中转化后，挑单克隆，摇菌后提取的质粒，然后做的PCR。是否是本来从表达感受态BL21DE3中提取质粒浓度低，造成的条带不清晰的结果呢？我能否将泳道2的质粒转化DH5a，然后挑单克隆在验证是否连接成功了呢？谢谢了！
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7楼2011-04-28 16:38:59
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xiaoyu1014126

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-04-28 16:53:35
提质粒酶切验证最好
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8楼2011-04-28 16:44:17
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): Good！快检的方法很好，我们实验室也常用。 2011-04-28 16:54:30
我觉得验证这种重组质粒最好先快检一下然后再提质粒酶切，没必要直接PCR。
快检就是直接用摇起的菌液取100uL，加50uL的苯酚和50uL的氯仿涡旋离心，取上清跑胶，对照上个空载体，就是没有连片段前的质粒（环合的哈），或者和你载体差不多大小的质粒也可，一般连进去的重组质粒会跑得慢点，凭这个就能鉴定哪些连进去了，然后再提质粒酶切就好了
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在等待中涅槃重生
9楼2011-04-28 16:52:45
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
1949stone(金币+3): 快转正 2011-04-28 19:03:51
引用回帖:
Originally posted by wzc4884 at 2011-04-28 16:38:59:
谢谢大家的帮助，正如您所说的，我确实像验证是否连接成功，呵呵。2号泳道是我从BL21DE3中转化后，挑单克隆，摇菌后提取的质粒，然后做的PCR。是否是本来从表达感受态BL21DE3中提取质粒浓度低，造成的条带不清晰的 ...

虽然BL21提质粒不是很好，但并不是提不了，而且PCR对模板的量要求很少，个人认为不是质粒浓度低的原因。

你可以同时把泳道2的质粒和空载体一起跑胶比较大小，就知道有没有连进去了。

最后酶切验证即可。PCR在这方面的假阳性率还是比较高的，酶切相对可靠些。
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10楼2011-04-28 16:53:17
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