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wzc4884

金虫 (正式写手)

[求助] 求PCR解！谢谢！

大家好，求解PCR，希望大家指点一下。附件是我今天做的PCR结果。泳道14是阴性PCR对照即模板是2微升二次水，泳道11、12是阳性PCR结果，泳道2至10是待检验的菌液，（其中菌液是从构建的重组质粒中转化BL21DE3后，挑取单克隆摇起的菌液，直接加2微升菌液进行的PCR）。请大家帮助分析下，是否是阳性结果呢？还是根本就是假阳性的单克隆呢？谢谢了！
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1楼 2011-04-28 15:50:14
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
1949stone(金币+3): 快转正 2011-04-28 19:03:51
引用回帖:
Originally posted by wzc4884 at 2011-04-28 16:38:59:
谢谢大家的帮助，正如您所说的，我确实像验证是否连接成功，呵呵。2号泳道是我从BL21DE3中转化后，挑单克隆，摇菌后提取的质粒，然后做的PCR。是否是本来从表达感受态BL21DE3中提取质粒浓度低，造成的条带不清晰的 ...

虽然BL21提质粒不是很好，但并不是提不了，而且PCR对模板的量要求很少，个人认为不是质粒浓度低的原因。

你可以同时把泳道2的质粒和空载体一起跑胶比较大小，就知道有没有连进去了。

最后酶切验证即可。PCR在这方面的假阳性率还是比较高的，酶切相对可靠些。
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10楼2011-04-28 16:53:17
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
1949stone(金币+1): 鼓励 2011-04-28 19:03:10
1有可能是对的，其他的大小和你阳性有差别，建议1提质粒酶切验证
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在等待中涅槃重生
2楼2011-04-28 16:16:01
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

wzc4884(金币+1): 谢谢！ 2011-04-28 16:35:36
说错了，是第二道可能是对的
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在等待中涅槃重生
3楼2011-04-28 16:16:38
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
Originally posted by wzc4884 at 2011-04-28 15:50:14:
大家好，求解PCR，希望大家指点一下。附件是我今天做的PCR结果。泳道14是阴性PCR对照即模板是2微升二次水，泳道11、12是阳性PCR结果，泳道2至10是待检验的菌液，（其中菌液是从构建的重组质粒中转化BL21DE3后，挑 ...

我也举得泳道2（maker右边第一个）是对的。可以提质粒，跟载体一起跑胶，跑久点，如果是重组质粒，会比载体跑得慢，从胶上可以看出来。之后再酶切最后验证。
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4楼2011-04-28 16:19:13
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