应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求富含GC的片段的PCR条件
111/1返回列表
查看: 1804  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

aaron2012

银虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】求富含GC的片段的PCR条件

各位大侠，不知道各位在做富含GC片段的时候有没有什么心得，比较好的PCR条件。其他还需要注意的事项。希望得到大家的帮助。谢谢！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2011-03-10 14:51:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bijing_1111

新虫 (初入文坛)
★
aaron2012(金币+3): 2011-03-10 15:49:40
最爱花诗雨(金币+1): 鼓励新虫交流~~ 2011-03-10 17:12:33
做过GC含量70%多的片段扩增，用了GC Buffer（好像是TAKARA的），参照说明书的条件，体系没有什么特别，主要是变性时间不要太长，一分钟就够了，GC Buffer裂解能力很强，循环中10s变性就够了。酶根据你的片段要求选择，没要求普通tag酶就ok。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-03-10 15:14:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

101202139

铜虫 (小有名气)
aaron2012(金币+1): 2011-03-10 15:49:31
最好加入5%-10%的DMSO（二甲基亚砜）
赞一下 回复此楼
3楼2011-03-10 15:40:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

aaron2012

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by bijing_1111 at 2011-03-10 15:14:24:
做过GC含量70%多的片段扩增，用了GC Buffer（好像是TAKARA的），参照说明书的条件，体系没有什么特别，主要是变性时间不要太长，一分钟就够了，GC Buffer裂解能力很强，循环中10s变性就够了。酶根据你的片段要求选 ...

你说的变性时间是指最开始的那个变性时间，还是循环里的变形时间？
我这阵子也有10×GCEnhencer。你们在做的时候一般加多少啊？
赞一下 回复此楼
4楼2011-03-10 15:48:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

aaron2012

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 101202139 at 2011-03-10 15:40:31:
最好加入5%-10%的DMSO（二甲基亚砜）

看有关文献   说退火温度对其影响也很大   今天有加DMSO还是没有带出来
赞一下 回复此楼
5楼2011-03-10 15:49:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yabxxh

木虫 (正式写手)
★ ★
aaron2012(金币+3): 2011-03-10 16:26:30
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-03-10 19:34:59
呵呵，我是克隆过一段人的基因，GC含量非常高，用的是TAKARA的primerstar hs热启动版，gc buffer II，注意片段长度，退火10s足够，应该不是很难得到。真不行前面加一段60度得降落PCR（约5个循环），后面TM值扩增。好运
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2011-03-10 15:50:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

aaron2012

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-03-10 15:50:55:
呵呵，我是克隆过一段人的基因，GC含量非常高，用的是TAKARA的primerstar hs热启动版，gc buffer II，注意片段长度，退火10s足够，应该不是很难得到。真不行前面加一段60度得降落PCR（约5个循环），后面TM值扩增。 ...

请问你用的简并引物  还是特异引物啊     能不能把你具体的PCR条件告诉我一下  谢谢
赞一下 回复此楼
7楼2011-03-10 16:26:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bijing_1111

新虫 (初入文坛)
aaron2012(金币+1): 2011-03-12 08:32:30
aaron2012(金币+1): 2011-03-12 08:35:06
引用回帖:
Originally posted by aaron2012 at 2011-03-10 15:48:15:
你说的变性时间是指最开始的那个变性时间，还是循环里的变形时间？
我这阵子也有10×GCEnhencer。你们在做的时候一般加多少啊？

预变性1min，循环中10s。Buffer终浓度都是1×的，我用过的GC Buffer是2×GC Buffer 2，好像是TAKARA的。
赞一下 回复此楼
8楼2011-03-11 09:27:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yabxxh

木虫 (正式写手)
aaron2012(金币+1): 2011-03-12 08:35:14
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-03-10 15:50:55:
呵呵，我是克隆过一段人的基因，GC含量非常高，用的是TAKARA的primerstar hs热启动版，gc buffer II，注意片段长度，退火10s足够，应该不是很难得到。真不行前面加一段60度得降落PCR（约5个循环），后面TM值扩增。 ...

呵呵，我用的是PCR特异引物，你要用兼并引物的话，要注意Tm算法。我的条件不一定适合你的，就是普通的两步法，在第一步后面加上一步95度1min，效果可能会好点，goodluck
赞一下 回复此楼
9楼2011-03-11 09:53:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wqj1988926

金虫 (正式写手)
提高退火温度
http://old.biovip.com/content/20050513/13054.htm
可以看看这个
赞一下 回复此楼
10楼2011-03-11 11:23:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fywjp

木虫 (正式写手)
相关文献有很多，去年AC就有一篇啊，上网查一下就行了
赞一下 回复此楼
11楼2011-03-11 14:18:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 aaron2012 的主题更新
111/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭