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aaron2012

银虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】求富含GC的片段的PCR条件

各位大侠，不知道各位在做富含GC片段的时候有没有什么心得，比较好的PCR条件。其他还需要注意的事项。希望得到大家的帮助。谢谢！
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1楼 2011-03-10 14:51:54
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bijing_1111

新虫 (初入文坛)
★
aaron2012(金币+3): 2011-03-10 15:49:40
最爱花诗雨(金币+1): 鼓励新虫交流~~ 2011-03-10 17:12:33
做过GC含量70%多的片段扩增，用了GC Buffer（好像是TAKARA的），参照说明书的条件，体系没有什么特别，主要是变性时间不要太长，一分钟就够了，GC Buffer裂解能力很强，循环中10s变性就够了。酶根据你的片段要求选择，没要求普通tag酶就ok。
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2楼2011-03-10 15:14:24
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101202139

铜虫 (小有名气)
aaron2012(金币+1): 2011-03-10 15:49:31
最好加入5%-10%的DMSO（二甲基亚砜）
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3楼2011-03-10 15:40:31
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aaron2012

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by bijing_1111 at 2011-03-10 15:14:24:
做过GC含量70%多的片段扩增，用了GC Buffer（好像是TAKARA的），参照说明书的条件，体系没有什么特别，主要是变性时间不要太长，一分钟就够了，GC Buffer裂解能力很强，循环中10s变性就够了。酶根据你的片段要求选 ...

你说的变性时间是指最开始的那个变性时间，还是循环里的变形时间？
我这阵子也有10×GCEnhencer。你们在做的时候一般加多少啊？
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4楼2011-03-10 15:48:15
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aaron2012

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 101202139 at 2011-03-10 15:40:31:
最好加入5%-10%的DMSO（二甲基亚砜）

看有关文献   说退火温度对其影响也很大   今天有加DMSO还是没有带出来
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5楼2011-03-10 15:49:21
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yabxxh

木虫 (正式写手)
★ ★
aaron2012(金币+3): 2011-03-10 16:26:30
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-03-10 19:34:59
呵呵，我是克隆过一段人的基因，GC含量非常高，用的是TAKARA的primerstar hs热启动版，gc buffer II，注意片段长度，退火10s足够，应该不是很难得到。真不行前面加一段60度得降落PCR（约5个循环），后面TM值扩增。好运
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6楼2011-03-10 15:50:55
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aaron2012

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-03-10 15:50:55:
呵呵，我是克隆过一段人的基因，GC含量非常高，用的是TAKARA的primerstar hs热启动版，gc buffer II，注意片段长度，退火10s足够，应该不是很难得到。真不行前面加一段60度得降落PCR（约5个循环），后面TM值扩增。 ...

请问你用的简并引物  还是特异引物啊     能不能把你具体的PCR条件告诉我一下  谢谢
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7楼2011-03-10 16:26:19
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bijing_1111

新虫 (初入文坛)
aaron2012(金币+1): 2011-03-12 08:32:30
aaron2012(金币+1): 2011-03-12 08:35:06
引用回帖:
Originally posted by aaron2012 at 2011-03-10 15:48:15:
你说的变性时间是指最开始的那个变性时间，还是循环里的变形时间？
我这阵子也有10×GCEnhencer。你们在做的时候一般加多少啊？

预变性1min，循环中10s。Buffer终浓度都是1×的，我用过的GC Buffer是2×GC Buffer 2，好像是TAKARA的。
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8楼2011-03-11 09:27:33
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yabxxh

木虫 (正式写手)
aaron2012(金币+1): 2011-03-12 08:35:14
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-03-10 15:50:55:
呵呵，我是克隆过一段人的基因，GC含量非常高，用的是TAKARA的primerstar hs热启动版，gc buffer II，注意片段长度，退火10s足够，应该不是很难得到。真不行前面加一段60度得降落PCR（约5个循环），后面TM值扩增。 ...

呵呵，我用的是PCR特异引物，你要用兼并引物的话，要注意Tm算法。我的条件不一定适合你的，就是普通的两步法，在第一步后面加上一步95度1min，效果可能会好点，goodluck
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9楼2011-03-11 09:53:19
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wqj1988926

金虫 (正式写手)
提高退火温度
http://old.biovip.com/content/20050513/13054.htm
可以看看这个
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10楼2011-03-11 11:23:00
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fywjp

木虫 (正式写手)
相关文献有很多，去年AC就有一篇啊，上网查一下就行了
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11楼2011-03-11 14:18:33
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