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飞翔的诗人

银虫 (小有名气)

[求助] 1.5kb的 PCR目的序列GC含量高达67%，引物Tm值达90℃，怎么P比较好？

本人根据目的序列的CDS区设计出引物，由于目的序列本身GC含量达67%，设计出的引物GC含量也超过了60%，oligo给出的两条引物的Tm值均在90℃左右，其推荐的退火温度为68.4℃（最高72度），
上游 5'-tcGAATTCatgtcccagc ccgacgccac cccgtt-3' (EcoR I酶切位点)
下游 5'-tctAAGCTTtcaggctccg gcccggttga ggacg-3'（Hind III酶切位点）
oligo最后给引物的PCR评价没问题，不过这么高的GC含量，该怎么P比较好？如果是用带GC缓冲液的Taq酶，梯度PCR反应条件该如何设计？
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飞翔的诗人

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1楼 2011-08-29 12:49:40
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

飞翔的诗人

银虫 (小有名气)
谢谢你的回复，有几个问题再问下，首先是为什么要加上4－5个保护碱基，还有加入DMSO起了什么作用，每个循环降0.2是指退火温度降0.2度吗？
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3楼2011-08-29 14:56:14
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
呵呵，我们做的物种GC含量平均还在66%左右！
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jiayoubashaonian
4楼2011-08-29 14:58:08
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普通回帖

空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
飞翔的诗人(金币+10): 5 2011-08-29 14:49:28
西瓜(金币+3): Good 2011-08-29 17:50:35
1.建议你把保护碱基的数量增加到4-5个
2.你说的GC缓冲液我没用过，不过你可以在扩增体系中加入DMSO，扩增程序可以这么设置看看行不行：
96℃  5min
96℃  30s
63℃  20s
72℃  2min
设置30个循环，每个循环降0.2
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
2楼2011-08-29 13:19:19
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飞翔的诗人

银虫 (小有名气)
哦，那你们用的是什么样的PCR反应体系啊？这样的目的片段好P吗？
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5楼2011-08-29 15:17:11
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 很好很强大！我都没有发挥的机会了…… 2011-08-29 17:51:41
引用回帖:
3楼: Originally posted by 飞翔的诗人 at 2011-08-29 14:56:14:
谢谢你的回复，有几个问题再问下，首先是为什么要加上4－5个保护碱基，还有加入DMSO起了什么作用，每个循环降0.2是指退火温度降0.2度吗？

1.因为限制性内切酶要发生酶切的前提是先结合在酶切位点上，不同的限制性内切酶结合的碱基数不一样，最少的是在识别位点的两端要多出一个碱基，有的要多出好几个；再加上PCR得到的片段两端很容易丢失碱基，所以，对于一般的限制性内切酶来说添加4-6个保护碱基是比较保险的，否则可能会导致无法发生酶切
2.DMSO可以使双链在稍低的温度下（相比较不加DMSO而言）发生解离。
3.是指退火温度
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
6楼2011-08-29 15:37:03
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飞翔的诗人

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
谢谢，学习了，呵呵，再问下引物Tm值90℃行不行，还是调低点好吧，不过我试过，改变保护碱基比例后最低Tm也有85℃
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7楼2011-08-29 16:03:33
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litianfeng

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-08-29 15:37:03:
1.因为限制性内切酶要发生酶切的前提是先结合在酶切位点上，不同的限制性内切酶结合的碱基数不一样，最少的是在识别位点的两端要多出一个碱基，有的要多出好几个；再加上PCR得到的片段两端很容易丢失碱基，所以， ...

我要的片段GC含量也很高，扩了好几次都扩不出来，总是出现好多其他的条带，加入DMSO可以吗？
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8楼2011-08-29 16:11:10
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peace12039088

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good！ 2011-08-29 17:52:10
就我做过的梯度PCR而言，其反应体系和一般PCR体系是一样的，只是在P的时候放在梯度PCR仪中进行而已，从左至右12个孔又12个不同的温度，其中第一孔与最后一孔分别是你梯度范围的最低、最高温度（梯度范围需在在PCR仪上设好）。此外，针对GC含量高的问题，我选的是可扩展高GC含量的Taq 及GC buffer，DMSO没有亲自用过，据说添加体系有些繁琐。还有引物设计软件显示的Tm值不一定就是实际扩增时的Tm值。总之做下梯度应该有所收获。
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9楼2011-08-29 16:47:15
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 飞翔的诗人 at 2011-08-29 14:56:14:
谢谢你的回复，有几个问题再问下，首先是为什么要加上4－5个保护碱基，还有加入DMSO起了什么作用，每个循环降0.2是指退火温度降0.2度吗？

楼主试下“引用回复”功能吧，这样可以通知到对方哦~
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10楼2011-08-29 17:51:13
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