应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 1.5kb的 PCR目的序列GC含量高达67%，引物Tm值达90℃，怎么P比较好？
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
172/2返回列表上一页12
查看: 4471  |  回复: 16
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

空谷幽风

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by litianfeng at 2011-08-29 16:11:10:
我要的片段GC含量也很高，扩了好几次都扩不出来，总是出现好多其他的条带，加入DMSO可以吗？

如果GC含量比较高，建议你加DMSO
赞一下 回复此楼
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
11楼2011-08-29 18:57:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

空谷幽风

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 飞翔的诗人 at 2011-08-29 16:03:33:
谢谢，学习了，呵呵，再问下引物Tm值90℃行不行，还是调低点好吧，不过我试过，改变保护碱基比例后最低Tm也有85℃

能调的话就尽量调低点
赞一下 回复此楼
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
12楼2011-08-29 18:58:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

飞翔的诗人

银虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-08-29 18:58:49:
能调的话就尽量调低点

引物中保护碱基和酶切位点加起来共9个碱基，目的序列选了22个碱基（所以引物是31个），这样引物Tm值稍微低点也有88度，而目的序列如果选25个碱基的话，Tm值就有90几度了。问了下师兄说前面保护碱基和酶切位点是9个的话，后面的目的序列一般要25个以上，但考虑到Tm温度还是只选了22 个，我的目的序列是1.5kb大,不知道行不行啊。
赞一下 回复此楼
13楼2011-08-29 19:28:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

空谷幽风

金虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 飞翔的诗人 at 2011-08-29 19:28:51:
引物中保护碱基和酶切位点加起来共9个碱基，目的序列选了22个碱基（所以引物是31个），这样引物Tm值稍微低点也有88度，而目的序列如果选25个碱基的话，Tm值就有90几度了。问了下师兄说前面保护碱基和酶切位点是9 ...

其实18个就足够了，建议你能把保护碱基加到4个以上
赞一下 回复此楼
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
14楼2011-08-29 19:41:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

飞翔的诗人

银虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-08-29 19:41:40:
其实18个就足够了，建议你能把保护碱基加到4个以上

嗯，这样我就放心了，不过从有的文献看到，由于目的序列GC含量较高，估计加保护碱基后，通过常规PCR扩增直插表达载体可能会有困难，不过我还是先试试吧，实在不行的话就考虑连T载体，再亚克隆到PET28a上。另外，我在设计酶切位点时，还是保留了PET28a上的HisTag,T7Tag和Thrombin，从阅读框看，最后表达的时候这些东西会连在目的蛋白的N-端，虽然HisTag有利于纯化，但这些东西对酶的活性会有一定影响吧，因为我最后要检测表达的酶活，所以还是有点担心啊
赞一下 回复此楼
15楼2011-08-29 20:01:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

空谷幽风

金虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 飞翔的诗人 at 2011-08-29 20:01:44:
嗯，这样我就放心了，不过从有的文献看到，由于目的序列GC含量较高，估计加保护碱基后，通过常规PCR扩增直插表达载体可能会有困难，不过我还是先试试吧，实在不行的话就考虑连T载体，再亚克隆到PET28a上。另外， ...

蛋白方面我就外行了，呵呵
赞一下 回复此楼
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
16楼2011-08-29 20:37:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yangjianchen

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 飞翔的诗人 at 2011-08-29 15:17:11
哦，那你们用的是什么样的PCR反应体系啊？这样的目的片段好P吗？

请教一下：一般PCR体系（以50ul为例），应加入多少DMSO呢？
赞一下 回复此楼
17楼2013-05-28 15:20:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 飞翔的诗人 的主题更新
172/2返回列表上一页12
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 086000生物与医药298调剂求助 +9 元元青青 2026-03-31 12/600 2026-04-05 21:03 by 学员8dgXkO
[考研] 301求调剂 +5 细胞相关蛋白 2026-04-02 9/450 2026-04-05 20:14 by lys0704
[考研] 生物与医药调剂 +4 十七sa 2026-04-05 4/200 2026-04-05 20:05 by lys0704
[考研] 材料专硕283求调剂 +14 试试看呗 2026-04-04 15/750 2026-04-05 19:21 by jkddd
[考研] 301求调剂 +3 XYPLR 2026-04-05 4/200 2026-04-05 19:07 by XYPLR
[考研] 工科08-机械专硕-求调剂 +3 雷欧飞踢 2026-04-02 3/150 2026-04-05 18:49 by 蓝云思雨
[考研] 一志愿同济大学323分（080500）求调剂 +8 yikeniu 2026-04-01 8/400 2026-04-05 18:15 by cql1109
[考研] 285求调剂 +5 AZMK 2026-04-04 7/350 2026-04-05 17:16 by yulian1987
[考研] 一志愿北交大材料工程总分358求调剂 +6 cs0106 2026-04-05 6/300 2026-04-05 16:34 by imissbao
[考研] 344材料与化工调剂 +9 调剂上岸玘 2026-04-03 9/450 2026-04-04 23:10 by happyddm
[考研] 295求调剂 +4 A你好研究生 2026-04-04 5/250 2026-04-04 22:46 by yu221
[考研] 303求调剂 +9 DLkz1314. 2026-03-30 9/450 2026-04-03 18:34 by ls刘帅
[考研] 283求调剂 +3 jiouuu 2026-04-03 4/200 2026-04-03 13:28 by jiouuu
[考研] 08工科，295，接受跨专业调剂 +8 lmnlzy 2026-03-30 8/400 2026-04-03 13:08 by nalakaiqi
[考研] 320求调剂 +3 农业工程与信息� 2026-04-03 3/150 2026-04-03 11:40 by 土木硕士招生
[考研] 专硕 351 086100 也是考的材科基 本科也是材料 +8 202451007219 2026-04-02 8/400 2026-04-03 09:50 by 蓝云思雨
[考研] 310分求调剂 +4 成功上岸wang 2026-04-01 4/200 2026-04-01 20:35 by liu823948201
[考研] 085600，321分求调剂 +13 大馋小子 2026-03-31 13/650 2026-04-01 12:35 by chemdavid
[考研] 267求调剂 +13 uiybh 2026-03-31 13/650 2026-04-01 10:25 by 探123
[考研] 一志愿西电085401数一英一299求调剂 六级521 +4 爱吃大鸭梨 2026-03-31 4/200 2026-03-31 11:51 by 搏击518
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭