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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 1.5kb的 PCR目的序列GC含量高达67%，引物Tm值达90℃，怎么P比较好？
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
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8楼: Originally posted by litianfeng at 2011-08-29 16:11:10:
我要的片段GC含量也很高，扩了好几次都扩不出来，总是出现好多其他的条带，加入DMSO可以吗？

如果GC含量比较高，建议你加DMSO
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11楼2011-08-29 18:57:25
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 飞翔的诗人 at 2011-08-29 16:03:33:
谢谢，学习了，呵呵，再问下引物Tm值90℃行不行，还是调低点好吧，不过我试过，改变保护碱基比例后最低Tm也有85℃

能调的话就尽量调低点
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12楼2011-08-29 18:58:49
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飞翔的诗人

银虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-08-29 18:58:49:
能调的话就尽量调低点

引物中保护碱基和酶切位点加起来共9个碱基，目的序列选了22个碱基（所以引物是31个），这样引物Tm值稍微低点也有88度，而目的序列如果选25个碱基的话，Tm值就有90几度了。问了下师兄说前面保护碱基和酶切位点是9个的话，后面的目的序列一般要25个以上，但考虑到Tm温度还是只选了22 个，我的目的序列是1.5kb大,不知道行不行啊。
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13楼2011-08-29 19:28:51
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 飞翔的诗人 at 2011-08-29 19:28:51:
引物中保护碱基和酶切位点加起来共9个碱基，目的序列选了22个碱基（所以引物是31个），这样引物Tm值稍微低点也有88度，而目的序列如果选25个碱基的话，Tm值就有90几度了。问了下师兄说前面保护碱基和酶切位点是9 ...

其实18个就足够了，建议你能把保护碱基加到4个以上
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14楼2011-08-29 19:41:40
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飞翔的诗人

银虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-08-29 19:41:40:
其实18个就足够了，建议你能把保护碱基加到4个以上

嗯，这样我就放心了，不过从有的文献看到，由于目的序列GC含量较高，估计加保护碱基后，通过常规PCR扩增直插表达载体可能会有困难，不过我还是先试试吧，实在不行的话就考虑连T载体，再亚克隆到PET28a上。另外，我在设计酶切位点时，还是保留了PET28a上的HisTag,T7Tag和Thrombin，从阅读框看，最后表达的时候这些东西会连在目的蛋白的N-端，虽然HisTag有利于纯化，但这些东西对酶的活性会有一定影响吧，因为我最后要检测表达的酶活，所以还是有点担心啊
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15楼2011-08-29 20:01:44
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 飞翔的诗人 at 2011-08-29 20:01:44:
嗯，这样我就放心了，不过从有的文献看到，由于目的序列GC含量较高，估计加保护碱基后，通过常规PCR扩增直插表达载体可能会有困难，不过我还是先试试吧，实在不行的话就考虑连T载体，再亚克隆到PET28a上。另外， ...

蛋白方面我就外行了，呵呵
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16楼2011-08-29 20:37:20
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yangjianchen

铜虫 (小有名气)
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5楼: Originally posted by 飞翔的诗人 at 2011-08-29 15:17:11
哦，那你们用的是什么样的PCR反应体系啊？这样的目的片段好P吗？

请教一下：一般PCR体系（以50ul为例），应加入多少DMSO呢？
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17楼2013-05-28 15:20:18
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