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空谷幽风

金虫 (正式写手)

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8楼: Originally posted by litianfeng at 2011-08-29 16:11:10:
我要的片段GC含量也很高,扩了好几次都扩不出来,总是出现好多其他的条带,加入DMSO可以吗?

如果GC含量比较高,建议你加DMSO
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
11楼2011-08-29 18:57:25
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

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7楼: Originally posted by 飞翔的诗人 at 2011-08-29 16:03:33:
谢谢,学习了,呵呵,再问下引物Tm值90℃行不行,还是调低点好吧,不过我试过,改变保护碱基比例后最低Tm也有85℃

能调的话就尽量调低点
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12楼2011-08-29 18:58:49
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飞翔的诗人

银虫 (小有名气)

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12楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-08-29 18:58:49:
能调的话就尽量调低点

引物中保护碱基和酶切位点加起来共9个碱基,目的序列选了22个碱基(所以引物是31个),这样引物Tm值稍微低点也有88度,而目的序列如果选25个碱基的话,Tm值就有90几度了。问了下师兄说前面保护碱基和酶切位点是9个的话,后面的目的序列一般要25个以上,但考虑到Tm温度还是只选了22 个,我的目的序列是1.5kb大,不知道行不行啊。
13楼2011-08-29 19:28:51
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

引用回帖:
13楼: Originally posted by 飞翔的诗人 at 2011-08-29 19:28:51:
引物中保护碱基和酶切位点加起来共9个碱基,目的序列选了22个碱基(所以引物是31个),这样引物Tm值稍微低点也有88度,而目的序列如果选25个碱基的话,Tm值就有90几度了。问了下师兄说前面保护碱基和酶切位点是9 ...

其实18个就足够了,建议你能把保护碱基加到4个以上
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14楼2011-08-29 19:41:40
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飞翔的诗人

银虫 (小有名气)

引用回帖:
14楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-08-29 19:41:40:
其实18个就足够了,建议你能把保护碱基加到4个以上

嗯,这样我就放心了,不过从有的文献看到,由于目的序列GC含量较高,估计加保护碱基后,通过常规PCR扩增直插表达载体可能会有困难,不过我还是先试试吧,实在不行的话就考虑连T载体,再亚克隆到PET28a上。另外,我在设计酶切位点时,还是保留了PET28a上的HisTag,T7Tag和Thrombin,从阅读框看,最后表达的时候这些东西会连在目的蛋白的N-端,虽然HisTag有利于纯化,但这些东西对酶的活性会有一定影响吧,因为我最后要检测表达的酶活,所以还是有点担心啊
15楼2011-08-29 20:01:44
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

引用回帖:
15楼: Originally posted by 飞翔的诗人 at 2011-08-29 20:01:44:
嗯,这样我就放心了,不过从有的文献看到,由于目的序列GC含量较高,估计加保护碱基后,通过常规PCR扩增直插表达载体可能会有困难,不过我还是先试试吧,实在不行的话就考虑连T载体,再亚克隆到PET28a上。另外, ...

蛋白方面我就外行了,呵呵
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16楼2011-08-29 20:37:20
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yangjianchen

铜虫 (小有名气)

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5楼: Originally posted by 飞翔的诗人 at 2011-08-29 15:17:11
哦,那你们用的是什么样的PCR反应体系啊?这样的目的片段好P吗?

请教一下:一般PCR体系(以50ul为例),应加入多少DMSO呢?
17楼2013-05-28 15:20:18
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