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aaron2012

银虫 (初入文坛)


[交流] 【求助/交流】求富含GC的片段的PCR条件

各位大侠,不知道各位在做富含GC片段的时候有没有什么心得,比较好的PCR条件。其他还需要注意的事项。希望得到大家的帮助。谢谢!
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yabxxh

木虫 (正式写手)


aaron2012(金币+1): 2011-03-12 08:35:14
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-03-10 15:50:55:
呵呵,我是克隆过一段人的基因,GC含量非常高,用的是TAKARA的primerstar hs热启动版,gc buffer II,注意片段长度,退火10s足够,应该不是很难得到。真不行前面加一段60度得降落PCR(约5个循环),后面TM值扩增。 ...

呵呵,我用的是PCR特异引物,你要用兼并引物的话,要注意Tm算法。我的条件不一定适合你的,就是普通的两步法,在第一步后面加上一步95度1min,效果可能会好点,goodluck
9楼2011-03-11 09:53:19
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bijing_1111

新虫 (初入文坛)



aaron2012(金币+3): 2011-03-10 15:49:40
最爱花诗雨(金币+1): 鼓励新虫交流~~ 2011-03-10 17:12:33
做过GC含量70%多的片段扩增,用了GC Buffer(好像是TAKARA的),参照说明书的条件,体系没有什么特别,主要是变性时间不要太长,一分钟就够了,GC Buffer裂解能力很强,循环中10s变性就够了。酶根据你的片段要求选择,没要求普通tag酶就ok。
2楼2011-03-10 15:14:24
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101202139

铜虫 (小有名气)


aaron2012(金币+1): 2011-03-10 15:49:31
最好加入5%-10%的DMSO(二甲基亚砜)
3楼2011-03-10 15:40:31
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aaron2012

银虫 (初入文坛)


引用回帖:
Originally posted by bijing_1111 at 2011-03-10 15:14:24:
做过GC含量70%多的片段扩增,用了GC Buffer(好像是TAKARA的),参照说明书的条件,体系没有什么特别,主要是变性时间不要太长,一分钟就够了,GC Buffer裂解能力很强,循环中10s变性就够了。酶根据你的片段要求选 ...

你说的变性时间是指最开始的那个变性时间,还是循环里的变形时间?
我这阵子也有10×GCEnhencer。你们在做的时候一般加多少啊?
4楼2011-03-10 15:48:15
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