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wzc4884

金虫 (正式写手)

[求助] 求PCR解！谢谢！

大家好，求解PCR，希望大家指点一下。附件是我今天做的PCR结果。泳道14是阴性PCR对照即模板是2微升二次水，泳道11、12是阳性PCR结果，泳道2至10是待检验的菌液，（其中菌液是从构建的重组质粒中转化BL21DE3后，挑取单克隆摇起的菌液，直接加2微升菌液进行的PCR）。请大家帮助分析下，是否是阳性结果呢？还是根本就是假阳性的单克隆呢？谢谢了！
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1楼2011-04-28 15:50:14
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4, EPI+1): 鼓励~ 2011-04-28 16:49:59
首先楼主你是想干什么？以后求助的时候一定得说清楚你想干什么？反正从你的帖子我没有很明确看出来你想干什么？
我猜：你是想验证你的基因是不是已经连接上了，然后就用菌液来进行PCR？如果正如我所说，我的建议如下：
1：泳道2有可能是对的，但是为神马这么模糊，你的对照都这么亮？
2：其它泳道不排除连上的概率，可以再进行一次PCR验证，体系得改改啊。。。
3：可以将有可能对的菌液提取质粒进行PCR（质粒当模板）；或者酶切验证。

PS:说说对于一般连接验证的步骤:
1:可以用菌液，也可以将菌划到板子上，我们常用后者；然后用菌液当模板进行PCR，结果会显示哪一个菌能够P出目的条带；
2：将疑似正确的菌提取质粒，跑电泳，点上空质粒作为对照，如果连上的话一般重组质粒会稍微大一些；
3：酶切质粒，电泳验证，记得点上酶切的基因和酶切的质粒进行对照。。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
6楼2011-04-28 16:32:09
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★
1949stone(金币+2): 最喜欢交流 2011-04-28 19:05:00
引用回帖:
Originally posted by yuxia82012 at 2011-04-28 16:52:45:
我觉得验证这种重组质粒最好先快检一下然后再提质粒酶切，没必要直接PCR。
快检就是直接用摇起的菌液取100uL，加50uL的苯酚和50uL的氯仿涡旋离心，取上清跑胶，对照上个空载体，就是没有连片段前的质粒（环合的哈 ...

快检？
我们实验室从没有提起过。。。这个方法是不是很迅速呢？
就是按照您所说的来做吗？取上清一般多少跑胶呢？出来条带又怎样呢？
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
12楼2011-04-28 18:00:47
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