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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 转化后菌液PCR鉴定，没有目的条带
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hzxm0316

铁虫 (初入文坛)

[求助] 转化后菌液PCR鉴定，没有目的条带

PCR时得到目的片段800bp，亮且单一，可是连接转化后，再菌液PCR鉴定，却始终只有200bp左右的条带，是怎么回事啊？有两次菌液鉴定得到800bp的单一亮条带，可是将测序结果提交到NCBI比对，却是没有找到相似序列？为什么就是转化不出目的序列呢？哪位大侠路过，请帮忙解答，谢谢！

（载体为PUCm-T Vecter；宿主为E.coli 5a）
（菌液鉴定：M13通用引物）
  实验均按照生工生物T-载体PCR产物克隆试剂盒上规定操作
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1楼2012-08-29 16:56:32
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

1949stone: 回帖置顶 2012-08-31 07:24:17
1949stone: MolEPI+1, 应助指数+1, 很好 很充分 2012-08-31 07:24:42
如果分子量都不对，那我觉得是从最开始找问题应该，每一步都CHECK一下。
PCR之后，跑胶，请加MARKER标定PCR产物分子量。
回收之后，请把回收产物用2-3微升跑胶，看分子量是否正确。
如果正确，连接转化。
转化后涂平板，培养，挑取单克隆。
单克隆菌液同时用通用引物及你的特异引物做PCR验证分子量是否正确。
如果正确就大量培养，提取质粒测序。
如果你们自己有测序仪，可以用纯化的PCR产物来测序，前提是分子量是正确的话。
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9楼2012-08-31 06:53:28
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王礼鹏

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 同意 2012-08-31 07:23:55
会不会你挑的菌是假阳性的呀，多挑几个试试，或酶切看看
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2楼2012-08-30 09:58:02
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 同意 2012-08-31 07:23:22
PCR很可能扩增得到有条带的假阳性克隆，你P的同时最好做个酶切验证，验证结果一致的再测序，这样是你需要的东东的可能性就更大！
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持之以恒、永不放弃！
3楼2012-08-30 10:14:59
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-30 14:47:26
如果你测序后获得800bp，但是比对没有同源性序列，说明是一个新序列。
如果测序结果只有200，只能说明你连接上的片段不对，或者是假阳性。最好，菌落PCR验证时，用通用引物和你自己的特异引物同时扩增来验证。
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5楼2012-08-30 13:12:12
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