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hzxm0316

铁虫 (初入文坛)

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[求助] 转化后菌液PCR鉴定，没有目的条带

PCR时得到目的片段800bp，亮且单一，可是连接转化后，再菌液PCR鉴定，却始终只有200bp左右的条带，是怎么回事啊？有两次菌液鉴定得到800bp的单一亮条带，可是将测序结果提交到NCBI比对，却是没有找到相似序列？为什么就是转化不出目的序列呢？哪位大侠路过，请帮忙解答，谢谢！

（载体为PUCm-T Vecter；宿主为E.coli 5a）
（菌液鉴定：M13通用引物）
实验均按照生工生物T-载体PCR产物克隆试剂盒上规定操作

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1楼2012-08-29 16:56:32

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chenguestc

木虫 (职业作家)

MolEPI: 7
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【答案】应助回帖

1949stone: 回帖置顶 2012-08-31 07:24:17
1949stone: MolEPI+1, 应助指数+1, 很好很充分 2012-08-31 07:24:42

如果分子量都不对，那我觉得是从最开始找问题应该，每一步都CHECK一下。
PCR之后，跑胶，请加MARKER标定PCR产物分子量。
回收之后，请把回收产物用2-3微升跑胶，看分子量是否正确。
如果正确，连接转化。
转化后涂平板，培养，挑取单克隆。
单克隆菌液同时用通用引物及你的特异引物做PCR验证分子量是否正确。
如果正确就大量培养，提取质粒测序。
如果你们自己有测序仪，可以用纯化的PCR产物来测序，前提是分子量是正确的话。