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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于引物
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魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】关于引物

现在，我有了载体，有了目的基因的片段。我的目的是为了把这段基因连到载体上让其表达。我想知道的是，我是否应该先大量制备这种载体和目的基因片段？ 如果是，那么，载体是要通过大量摇瓶培养导入载体的菌体然后裂解获得是吗？ 目的基因片段（外公司合成）是要经过PCR大量合成对吧？

问题来了，这段基因片段引物问题，我已经有了酶切位点。这段引物上有多少要与目的基因片段重合？3‘端是不是要留有一部分不与目的片段重合？这段不重合的大约要多少BP？

当我把重组子做好之后如何检验是否连接成功？ 没有诱导检测位点，IPTG什么的肯定不能用。用PCR应该也可以把？ 问题又来了，这时的PCR所用引物可以是前面扩增基因片段的引物吗？ 如果可以，那么再返回前面设计引物的阶段，我这个引物要与载体上片段重合多少BP？ 要有游离端吗？

纠结了一晚上，依然百思不得其解，求高人指点迷津~~~~
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1楼 2010-11-09 11:06:58
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
楼主应该好好去看一下分子克隆指南
所有的问题都可以得到解答
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2楼2010-11-09 11:12:40
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shan-sa

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997:编辑内容 2010-11-09 12:20
问问师兄师姐的哪个不知道

[ Last edited by dhd997 on 2010-11-9 at 12:20 ]
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3楼2010-11-09 11:21:47
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魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-11-09 11:12:40:
楼主应该好好去看一下分子克隆指南
所有的问题都可以得到解答

不知道这位朋友有没有看过，解释一下呗，分子克隆我看过了，没有寻着答案，我看的是零四年版本，不知这位兄台的是什么版本
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4楼2010-11-09 15:42:10
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魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by shan-sa at 2010-11-09 11:21:47:
问问师兄师姐的哪个不知道

[ Last edited by dhd997 on 2010-11-9 at 12:20 ]

哎 可悲的师兄师姐都说自己没设计过引物
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5楼2010-11-09 15:42:49
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-11-09 16:50:35
现在有种东西叫试剂盒。1  得到pcr产物 2 回收纯化pcr产物 3  用试剂盒连接   再然后你怎么转化 随你了。
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6楼2010-11-09 16:09:40
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引物3’端不能不重合，重合起码15bp以上吧
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7楼2010-11-09 16:44:22
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你用的什么载体呀？T载体吗？我用过Promega的PGEMTeasy和TAKARA的TMD18、TMD19,是TA连接，我没管酶切位点，我设计引物时也没添加酶切位点，转化时需加IPTG和Xgal，连接上后的菌落是白色，不用酶切，直接用菌液PCR检测，引物是我的目的片段的引物，菌液PCR的结果是扩出了目的条带
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8楼2010-11-09 17:55:06
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gao-feng

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
下一篇相关的文献看看就知道怎么做了
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9楼2010-11-09 18:13:45
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):感谢分享 2010-11-10 09:29:45
OK，现在我在做大量喝LZ类似的实验，其实primer和模板有18bp的重合足够了，前面你随便加什么改造，包括各种酶切位点及保护碱基。
你的实验很简单，只是最普通的载体构建，首先得到足量的基因片段，做酶切回收，连接，转化后菌液PCR，OK了。
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10楼2010-11-10 08:47:56
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魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yixuanwin at 2010-11-09 16:09:40:
现在有种东西叫试剂盒。1  得到pcr产物 2 回收纯化pcr产物 3  用试剂盒连接   再然后你怎么转化 随你了。

试剂盒貌似不管引物吧，你说的试剂盒可以用来提取DNA，里面的引物是通用引物，我的是已定基因和载体
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11楼2010-11-11 15:55:15
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魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by gongeleven at 2010-11-09 16:44:22:
引物3’端不能不重合，重合起码15bp以上吧

是吗？不是总长有个什么18bp到30几bp的限制吗？ 重合区太长这个限制不是就废掉了嘛
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12楼2010-11-11 15:59:33
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魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 阳光金鱼唐 at 2010-11-09 17:55:06:
你用的什么载体呀？T载体吗？我用过Promega的PGEMTeasy和TAKARA的TMD18、TMD19,是TA连接，我没管酶切位点，我设计引物时也没添加酶切位点，转化时需加IPTG和Xgal，连接上后的菌落是白色，不用酶切，直接用菌液PCR ...

不我不用T载体，这个载体是实验室的，因为是融合表达，你懂的，所以必须要酶切位点，而且这个位点还很纠结
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13楼2010-11-11 16:01:46
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魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by zhangxn2010 at 2010-11-10 08:47:56:
OK，现在我在做大量喝LZ类似的实验，其实primer和模板有18bp的重合足够了，前面你随便加什么改造，包括各种酶切位点及保护碱基。
你的实验很简单，只是最普通的载体构建，首先得到足量的基因片段，做酶切回收，连 ...

你好这位朋友，你的引物总长有多少BP？ TM值怎么计算的？ 3端是必须要加不匹配的保护位点吗？ 还有没有什么讲究？可否留个邮箱什么的我们细谈一下，我有好多地方不懂，想请教请教
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14楼2010-11-11 16:03:40
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
魑魅-魍魉(金币+10):太感谢了，终于遇到一个懂这个方面的人了，非常感谢 2010-11-12 08:39:19
lstt09nk(金币+2):不错，欢迎常来生物版 2010-11-12 09:20:37
引用回帖:
Originally posted by 魑魅-魍魉 at 2010-11-11 16:03:40:



你好这位朋友，你的引物总长有多少BP？ TM值怎么计算的？ 3端是必须要加不匹配的保护位点吗？ 还有没有什么讲究？可否留个邮箱什么的我们细谈一下，我有好多地方不懂，想请教请教

我一般至少选取18个重合碱基（3’端要重合），前面从5‘端到重合位点可以加酶切位点等，据我们实验室某位博士说前面加100bp都可以PCR出来，所以不用担心。
TM值仅供参考，我一般手算，A或T算2，G或C算4，只算重合区域。
实验初期建立信心很重要，等做习惯了，PCR应该不会是困扰你的问题。
我的邮箱：zhangxn2010@yahoo.cn,欢迎探讨，祝实验顺利.
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15楼2010-11-11 23:57:14
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★
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Originally posted by yixuanwin at 2010-11-09 16:09:40:
现在有种东西叫试剂盒。1  得到pcr产物 2 回收纯化pcr产物 3  用试剂盒连接   再然后你怎么转化 随你了。

回答的很简洁，我顶你！
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16楼2010-11-12 10:39:47
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最爱花诗雨

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
感觉没你想象的那么复杂，设计目的片段引物的时候根据载体加入酶切位点，PCR出来的片段是带有酶切位点，而后不就是酶切 连接吗？至于确定有没有成功，那得再设计在载体对应的酶切位点上游和下游的一段序列设计引物进行PCR鉴定就可以了啊，至于在多远的位置设计，只要不是太远就OK了吧。
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17楼2010-11-12 10:59:45
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk:建议不错，但是估计很难做到~哈哈 2010-11-12 15:08:38
建议把分子克隆上下册放枕头边上，从第一页看起
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18楼2010-11-12 12:34:20
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魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 最爱花诗雨 at 2010-11-12 10:59:45:
感觉没你想象的那么复杂，设计目的片段引物的时候根据载体加入酶切位点，PCR出来的片段是带有酶切位点，而后不就是酶切 连接吗？至于确定有没有成功，那得再设计在载体对应的酶切位点上游和下游的一段序列设计引物 ...

那我原来设计的这个引物上面拥有整合过质粒的部分位点，用这个只设计一次的引物不可以吗？
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19楼2010-11-12 13:15:19
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魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by amilie030312 at 2010-11-12 12:34:20:
建议把分子克隆上下册放枕头边上，从第一页看起

我也想啊，跟砖头一样，拿着都费劲，看着更纠结
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20楼2010-11-12 13:16:10
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 魑魅-魍魉 at 2010-11-11 15:59:33:


是吗？不是总长有个什么18bp到30几bp的限制吗？ 重合区太长这个限制不是就废掉了嘛

因为你是质粒PCR，长度无所谓的，特异性很好的。我经常用59bp的引物PCR。
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21楼2010-11-15 10:49:26
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