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[交流]
【求助/交流】关于引物
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现在,我有了载体,有了目的基因的片段。我的目的是为了把这段基因连到载体上让其表达。我想知道的是,我是否应该先大量制备这种载体和目的基因片段? 如果是,那么,载体是要通过大量摇瓶培养导入载体的菌体然后裂解获得是吗? 目的基因片段(外公司合成)是要经过PCR大量合成对吧? 问题来了,这段基因片段引物问题,我已经有了酶切位点。这段引物上有多少要与目的基因片段重合?3‘端是不是要留有一部分不与目的片段重合?这段不重合的大约要多少BP? 当我把重组子做好之后如何检验是否连接成功? 没有诱导检测位点,IPTG什么的肯定不能用。用PCR应该也可以把? 问题又来了,这时的PCR所用引物可以是前面扩增基因片段的引物吗? 如果可以,那么再返回前面设计引物的阶段,我这个引物要与载体上片段重合多少BP? 要有游离端吗? 纠结了一晚上,依然百思不得其解,求高人指点迷津~~~~ |
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小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
魑魅-魍魉(金币+10):太感谢了,终于遇到一个懂这个方面的人了,非常感谢 2010-11-12 08:39:19
lstt09nk(金币+2):不错,欢迎常来生物版 2010-11-12 09:20:37
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我一般至少选取18个重合碱基(3’端要重合),前面从5‘端到重合位点可以加酶切位点等,据我们实验室某位博士说前面加100bp都可以PCR出来,所以不用担心。 TM值仅供参考,我一般手算,A或T算2,G或C算4,只算重合区域。 实验初期建立信心很重要,等做习惯了,PCR应该不会是困扰你的问题。 我的邮箱:zhangxn2010@yahoo.cn,欢迎探讨,祝实验顺利. |
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