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魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 632.6
帖子: 373
在线: 35.6小时
虫号: 1065759

[交流] 【求助/交流】关于引物

现在，我有了载体，有了目的基因的片段。我的目的是为了把这段基因连到载体上让其表达。我想知道的是，我是否应该先大量制备这种载体和目的基因片段？如果是，那么，载体是要通过大量摇瓶培养导入载体的菌体然后裂解获得是吗？目的基因片段（外公司合成）是要经过PCR大量合成对吧？

问题来了，这段基因片段引物问题，我已经有了酶切位点。这段引物上有多少要与目的基因片段重合？3‘端是不是要留有一部分不与目的片段重合？这段不重合的大约要多少BP？

当我把重组子做好之后如何检验是否连接成功？没有诱导检测位点，IPTG什么的肯定不能用。用PCR应该也可以把？问题又来了，这时的PCR所用引物可以是前面扩增基因片段的引物吗？如果可以，那么再返回前面设计引物的阶段，我这个引物要与载体上片段重合多少BP？要有游离端吗？

纠结了一晚上，依然百思不得其解，求高人指点迷津~~~~

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1楼 2010-11-09 11:06:58

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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

MolEPI: 1
应助: 14 (小学生)
金币: 2450.9
帖子: 2880
在线: 284小时
虫号: 972619

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
魑魅-魍魉(金币+10):太感谢了，终于遇到一个懂这个方面的人了，非常感谢 2010-11-12 08:39:19
lstt09nk(金币+2):不错，欢迎常来生物版 2010-11-12 09:20:37

引用回帖:

Originally posted by 魑魅-魍魉 at 2010-11-11 16:03:40:

你好这位朋友，你的引物总长有多少BP？ TM值怎么计算的？ 3端是必须要加不匹配的保护位点吗？还有没有什么讲究？可否留个邮箱什么的我们细谈一下，我有好多地方不懂，想请教请教

我一般至少选取18个重合碱基（3’端要重合），前面从5‘端到重合位点可以加酶切位点等，据我们实验室某位博士说前面加100bp都可以PCR出来，所以不用担心。
TM值仅供参考，我一般手算，A或T算2，G或C算4，只算重合区域。
实验初期建立信心很重要，等做习惯了，PCR应该不会是困扰你的问题。
我的邮箱：zhangxn2010@yahoo.cn,欢迎探讨，祝实验顺利.