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听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

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[求助] 关于引物设计

我的EYFP荧光质粒克隆测序完后发现阅读框移动了，最后导致基因定位错误。

后来发现空载体上MCS插入区上少1个bp的密码子。然后被催的引物的从新设计，就是想问问谁有没有经验。。。在设计的引物酶切位点和cDNA起始序列ATG之前加1个A，是否可行。加1个bp够用吗。。。

[ Last edited by 1949stone on 2012-3-1 at 21:46 ]
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1楼 2012-03-01 02:32:08
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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小丹木木(金币+2): 鼓励应助交流 2012-03-01 09:53:44
听雪看山(金币+10): ★★★很有帮助 谢谢 2012-03-01 19:27:22
如果你的基因克隆到载体上表达时，用的是自带的起始密码子ATG，那么你只要保证克隆的目的基因的读框是完全正确（从ATG起始密码子后没有碱基的缺失导致读码框改变）。
如果你的基因克隆在载体上，利用的是载体上的起始密码子，那你就要注意克隆后，你的目的基因的读框必须与载体上的ATG读框保持一致。
总之，在ATG之前加碱基，没有用
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2楼2012-03-01 08:24:46
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hongqifei

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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小丹木木(金币+1): 鼓励 2012-03-01 17:06:08
听雪看山(金币+25): ★★★很有帮助 谢谢 2012-03-01 19:07:34
楼主的意思可能是：本来根据质粒图谱对好了阅读框，但结果空载的MCS缺了1bp导致移码。现在还是要用这个缺了1bp的空载，所以设计引物的时候在ATG前额外补上1bp，使阅读框对好。

如果是我想的这样，完全没问题。
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何须剑道争锋？千人指，万人封，可问江湖鼎峰，三尺秋水尘不染，天下无双。
3楼2012-03-01 13:06:04
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听雪看山

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3楼: Originally posted by hongqifei at 2012-03-01 13:06:04:
楼主的意思可能是：本来根据质粒图谱对好了阅读框，但结果空载的MCS缺了1bp导致移码。现在还是要用这个缺了1bp的空载，所以设计引物的时候在ATG前额外补上1bp，使阅读框对好。

如果是我想的这样，完全没问题。

如果 那1个bp补A应该没问题吧

主要就是补上这个缺失的不要引起新的终止子，和新的启动子，是吧。。。是否还有什么禁忌？？
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4楼2012-03-01 19:09:22
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听雪看山

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2楼: Originally posted by 酶切专家 at 2012-03-01 08:24:46:
如果你的基因克隆到载体上表达时，用的是自带的起始密码子ATG，那么你只要保证克隆的目的基因的读框是完全正确（从ATG起始密码子后没有碱基的缺失导致读码框改变）。
如果你的基因克隆在载体上，利用的是载体上的 ...

有点深奥，我没看懂。。。

我设计的引物是用来扩cDNA的，
载体MCS上的酶切位点我用XamI cccggg，
荧光蛋白eYFP也在MCS上由另一个酶切位点早已插入好了。我做的是基因5‘ 端的荧光定位，所以，eYFP在我要插入的cDNA之前。
问题出在eYFP与我的插入cDNA之间是17个bp的碱基，所以阅读框变了。我的准解决方法是，在扩cDNA引物的时候， 在设计的酶切位点cccggg 与cDNA的ATG起始密码子之间加1个bp，也许是一个A。。。这样eYFP和插入cDNA序列之间的就会是18个bp来防止读框出现错误。现在不知道加A是否可行而已
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5楼2012-03-01 19:26:54
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酶切专家

金虫 (小有名气)

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4楼: Originally posted by 听雪看山 at 2012-03-01 19:09:22:
如果 那1个bp补A应该没问题吧

主要就是补上这个缺失的不要引起新的终止子，和新的启动子，是吧。。。是否还有什么禁忌？？

读框是从你目的基因的ATG开始算的，所以在你目的基因ATG前的碱基多或少一个没有太大的关系。
我说的够明白了吧。
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6楼2012-03-01 20:44:13
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听雪看山

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6楼: Originally posted by 酶切专家 at 2012-03-01 20:44:13:
读框是从你目的基因的ATG开始算的，所以在你目的基因ATG前的碱基多或少一个没有太大的关系。
我说的够明白了吧。

目的基因之前碱基当然要能被三整除吧，否则又要frame shifting。你说是吧
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7楼2012-03-01 22:19:02
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hongqifei

木虫 (小有名气)
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4楼: Originally posted by 听雪看山 at 2012-03-01 19:09:22:
如果 那1个bp补A应该没问题吧

主要就是补上这个缺失的不要引起新的终止子，和新的启动子，是吧。。。是否还有什么禁忌？？

既然YFP在基因的5‘端，只要注意不产生终止密码子即可。
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8楼2012-03-01 22:43:32
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hongqifei

木虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by 酶切专家 at 2012-03-01 20:44:13:
读框是从你目的基因的ATG开始算的，所以在你目的基因ATG前的碱基多或少一个没有太大的关系。
我说的够明白了吧。

关键是YFP的orf在前面，后面的orf要和前面的对好，否则移码了后面的orf不能正常翻译。
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9楼2012-03-01 22:46:01
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海阔天空8158

木虫 (著名写手)

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听雪看山(金币+15): ★★★很有帮助 谢谢 2012-03-02 17:15:54
我看懂了，楼主的意思是：楼主的目的是把目的蛋白接在载体上的荧光蛋白之后，表达重组蛋白。
这样的话，楼主的准解决方法没错。只是要检测插入方向是否正确。

祝实验顺利。
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天行健，君子以自强不息；地势坤，君子以厚德载物。
10楼2012-03-02 11:41:11
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