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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于引物设计
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听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

优秀版主优秀版主

[求助] 关于引物设计

我的EYFP荧光质粒克隆测序完后发现阅读框移动了，最后导致基因定位错误。

后来发现空载体上MCS插入区上少1个bp的密码子。然后被催的引物的从新设计，就是想问问谁有没有经验。。。在设计的引物酶切位点和cDNA起始序列ATG之前加1个A，是否可行。加1个bp够用吗。。。

[ Last edited by 1949stone on 2012-3-1 at 21:46 ]
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开花可要欣赏，然后就去远行；唯有不等花开，才能记得花红。
1楼 2012-03-01 02:32:08
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hongqifei

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+1): 鼓励 2012-03-01 17:06:08
听雪看山(金币+25): ★★★很有帮助 谢谢 2012-03-01 19:07:34
楼主的意思可能是：本来根据质粒图谱对好了阅读框，但结果空载的MCS缺了1bp导致移码。现在还是要用这个缺了1bp的空载，所以设计引物的时候在ATG前额外补上1bp，使阅读框对好。

如果是我想的这样，完全没问题。
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何须剑道争锋？千人指，万人封，可问江湖鼎峰，三尺秋水尘不染，天下无双。
3楼2012-03-01 13:06:04
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 鼓励应助交流 2012-03-01 09:53:44
听雪看山(金币+10): ★★★很有帮助 谢谢 2012-03-01 19:27:22
如果你的基因克隆到载体上表达时，用的是自带的起始密码子ATG，那么你只要保证克隆的目的基因的读框是完全正确（从ATG起始密码子后没有碱基的缺失导致读码框改变）。
如果你的基因克隆在载体上，利用的是载体上的起始密码子，那你就要注意克隆后，你的目的基因的读框必须与载体上的ATG读框保持一致。
总之，在ATG之前加碱基，没有用
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2楼2012-03-01 08:24:46
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听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

优秀版主优秀版主
引用回帖:
3楼: Originally posted by hongqifei at 2012-03-01 13:06:04:
楼主的意思可能是：本来根据质粒图谱对好了阅读框，但结果空载的MCS缺了1bp导致移码。现在还是要用这个缺了1bp的空载，所以设计引物的时候在ATG前额外补上1bp，使阅读框对好。

如果是我想的这样，完全没问题。

如果 那1个bp补A应该没问题吧

主要就是补上这个缺失的不要引起新的终止子，和新的启动子，是吧。。。是否还有什么禁忌？？
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4楼2012-03-01 19:09:22
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听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

优秀版主优秀版主
引用回帖:
2楼: Originally posted by 酶切专家 at 2012-03-01 08:24:46:
如果你的基因克隆到载体上表达时，用的是自带的起始密码子ATG，那么你只要保证克隆的目的基因的读框是完全正确（从ATG起始密码子后没有碱基的缺失导致读码框改变）。
如果你的基因克隆在载体上，利用的是载体上的 ...

有点深奥，我没看懂。。。

我设计的引物是用来扩cDNA的，
载体MCS上的酶切位点我用XamI cccggg，
荧光蛋白eYFP也在MCS上由另一个酶切位点早已插入好了。我做的是基因5‘ 端的荧光定位，所以，eYFP在我要插入的cDNA之前。
问题出在eYFP与我的插入cDNA之间是17个bp的碱基，所以阅读框变了。我的准解决方法是，在扩cDNA引物的时候， 在设计的酶切位点cccggg 与cDNA的ATG起始密码子之间加1个bp，也许是一个A。。。这样eYFP和插入cDNA序列之间的就会是18个bp来防止读框出现错误。现在不知道加A是否可行而已
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5楼2012-03-01 19:26:54
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