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[交流]
【求助/交流】关于引物
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现在，我有了载体，有了目的基因的片段。我的目的是为了把这段基因连到载体上让其表达。我想知道的是，我是否应该先大量制备这种载体和目的基因片段？ 如果是，那么，载体是要通过大量摇瓶培养导入载体的菌体然后裂解获得是吗？ 目的基因片段（外公司合成）是要经过PCR大量合成对吧？ 问题来了，这段基因片段引物问题，我已经有了酶切位点。这段引物上有多少要与目的基因片段重合？3‘端是不是要留有一部分不与目的片段重合？这段不重合的大约要多少BP？ 当我把重组子做好之后如何检验是否连接成功？ 没有诱导检测位点，IPTG什么的肯定不能用。用PCR应该也可以把？ 问题又来了，这时的PCR所用引物可以是前面扩增基因片段的引物吗？ 如果可以，那么再返回前面设计引物的阶段，我这个引物要与载体上片段重合多少BP？ 要有游离端吗？ 纠结了一晚上，依然百思不得其解，求高人指点迷津~~~~ |
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