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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于引物
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查看: 2017  |  回复: 20
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魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】关于引物

现在，我有了载体，有了目的基因的片段。我的目的是为了把这段基因连到载体上让其表达。我想知道的是，我是否应该先大量制备这种载体和目的基因片段？ 如果是，那么，载体是要通过大量摇瓶培养导入载体的菌体然后裂解获得是吗？ 目的基因片段（外公司合成）是要经过PCR大量合成对吧？

问题来了，这段基因片段引物问题，我已经有了酶切位点。这段引物上有多少要与目的基因片段重合？3‘端是不是要留有一部分不与目的片段重合？这段不重合的大约要多少BP？

当我把重组子做好之后如何检验是否连接成功？ 没有诱导检测位点，IPTG什么的肯定不能用。用PCR应该也可以把？ 问题又来了，这时的PCR所用引物可以是前面扩增基因片段的引物吗？ 如果可以，那么再返回前面设计引物的阶段，我这个引物要与载体上片段重合多少BP？ 要有游离端吗？

纠结了一晚上，依然百思不得其解，求高人指点迷津~~~~
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1楼 2010-11-09 11:06:58
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最爱花诗雨

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
感觉没你想象的那么复杂，设计目的片段引物的时候根据载体加入酶切位点，PCR出来的片段是带有酶切位点，而后不就是酶切 连接吗？至于确定有没有成功，那得再设计在载体对应的酶切位点上游和下游的一段序列设计引物进行PCR鉴定就可以了啊，至于在多远的位置设计，只要不是太远就OK了吧。
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17楼2010-11-12 10:59:45
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
楼主应该好好去看一下分子克隆指南
所有的问题都可以得到解答
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2楼2010-11-09 11:12:40
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shan-sa

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997:编辑内容 2010-11-09 12:20
问问师兄师姐的哪个不知道

[ Last edited by dhd997 on 2010-11-9 at 12:20 ]
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3楼2010-11-09 11:21:47
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魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-11-09 11:12:40:
楼主应该好好去看一下分子克隆指南
所有的问题都可以得到解答

不知道这位朋友有没有看过，解释一下呗，分子克隆我看过了，没有寻着答案，我看的是零四年版本，不知这位兄台的是什么版本
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4楼2010-11-09 15:42:10
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