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魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)

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[交流] 【求助/交流】关于引物

现在，我有了载体，有了目的基因的片段。我的目的是为了把这段基因连到载体上让其表达。我想知道的是，我是否应该先大量制备这种载体和目的基因片段？如果是，那么，载体是要通过大量摇瓶培养导入载体的菌体然后裂解获得是吗？目的基因片段（外公司合成）是要经过PCR大量合成对吧？

问题来了，这段基因片段引物问题，我已经有了酶切位点。这段引物上有多少要与目的基因片段重合？3‘端是不是要留有一部分不与目的片段重合？这段不重合的大约要多少BP？

当我把重组子做好之后如何检验是否连接成功？没有诱导检测位点，IPTG什么的肯定不能用。用PCR应该也可以把？问题又来了，这时的PCR所用引物可以是前面扩增基因片段的引物吗？如果可以，那么再返回前面设计引物的阶段，我这个引物要与载体上片段重合多少BP？要有游离端吗？

纠结了一晚上，依然百思不得其解，求高人指点迷津~~~~

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1楼 2010-11-09 11:06:58

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魑魅-魍魉

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引用回帖:

Originally posted by 最爱花诗雨 at 2010-11-12 10:59:45:
感觉没你想象的那么复杂，设计目的片段引物的时候根据载体加入酶切位点，PCR出来的片段是带有酶切位点，而后不就是酶切连接吗？至于确定有没有成功，那得再设计在载体对应的酶切位点上游和下游的一段序列设计引物 ...

那我原来设计的这个引物上面拥有整合过质粒的部分位点，用这个只设计一次的引物不可以吗？