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魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)

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[交流] 【求助/交流】关于引物

现在，我有了载体，有了目的基因的片段。我的目的是为了把这段基因连到载体上让其表达。我想知道的是，我是否应该先大量制备这种载体和目的基因片段？如果是，那么，载体是要通过大量摇瓶培养导入载体的菌体然后裂解获得是吗？目的基因片段（外公司合成）是要经过PCR大量合成对吧？

问题来了，这段基因片段引物问题，我已经有了酶切位点。这段引物上有多少要与目的基因片段重合？3‘端是不是要留有一部分不与目的片段重合？这段不重合的大约要多少BP？

当我把重组子做好之后如何检验是否连接成功？没有诱导检测位点，IPTG什么的肯定不能用。用PCR应该也可以把？问题又来了，这时的PCR所用引物可以是前面扩增基因片段的引物吗？如果可以，那么再返回前面设计引物的阶段，我这个引物要与载体上片段重合多少BP？要有游离端吗？

纠结了一晚上，依然百思不得其解，求高人指点迷津~~~~

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1楼 2010-11-09 11:06:58

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魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)

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引用回帖:

Originally posted by 阳光金鱼唐 at 2010-11-09 17:55:06:
你用的什么载体呀？T载体吗？我用过Promega的PGEMTeasy和TAKARA的TMD18、TMD19,是TA连接，我没管酶切位点，我设计引物时也没添加酶切位点，转化时需加IPTG和Xgal，连接上后的菌落是白色，不用酶切，直接用菌液PCR ...

不我不用T载体，这个载体是实验室的，因为是融合表达，你懂的，所以必须要酶切位点，而且这个位点还很纠结