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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于引物
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魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】关于引物

现在，我有了载体，有了目的基因的片段。我的目的是为了把这段基因连到载体上让其表达。我想知道的是，我是否应该先大量制备这种载体和目的基因片段？ 如果是，那么，载体是要通过大量摇瓶培养导入载体的菌体然后裂解获得是吗？ 目的基因片段（外公司合成）是要经过PCR大量合成对吧？

问题来了，这段基因片段引物问题，我已经有了酶切位点。这段引物上有多少要与目的基因片段重合？3‘端是不是要留有一部分不与目的片段重合？这段不重合的大约要多少BP？

当我把重组子做好之后如何检验是否连接成功？ 没有诱导检测位点，IPTG什么的肯定不能用。用PCR应该也可以把？ 问题又来了，这时的PCR所用引物可以是前面扩增基因片段的引物吗？ 如果可以，那么再返回前面设计引物的阶段，我这个引物要与载体上片段重合多少BP？ 要有游离端吗？

纠结了一晚上，依然百思不得其解，求高人指点迷津~~~~
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1楼 2010-11-09 11:06:58
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引物3’端不能不重合，重合起码15bp以上吧
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7楼2010-11-09 16:44:22
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
楼主应该好好去看一下分子克隆指南
所有的问题都可以得到解答
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2楼2010-11-09 11:12:40
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shan-sa

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997:编辑内容 2010-11-09 12:20
问问师兄师姐的哪个不知道

[ Last edited by dhd997 on 2010-11-9 at 12:20 ]
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3楼2010-11-09 11:21:47
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魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-11-09 11:12:40:
楼主应该好好去看一下分子克隆指南
所有的问题都可以得到解答

不知道这位朋友有没有看过，解释一下呗，分子克隆我看过了，没有寻着答案，我看的是零四年版本，不知这位兄台的是什么版本
赞一下 回复此楼
4楼2010-11-09 15:42:10
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