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魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 632.6
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虫号: 1065759

[交流] 【求助/交流】关于引物

现在，我有了载体，有了目的基因的片段。我的目的是为了把这段基因连到载体上让其表达。我想知道的是，我是否应该先大量制备这种载体和目的基因片段？如果是，那么，载体是要通过大量摇瓶培养导入载体的菌体然后裂解获得是吗？目的基因片段（外公司合成）是要经过PCR大量合成对吧？

问题来了，这段基因片段引物问题，我已经有了酶切位点。这段引物上有多少要与目的基因片段重合？3‘端是不是要留有一部分不与目的片段重合？这段不重合的大约要多少BP？

当我把重组子做好之后如何检验是否连接成功？没有诱导检测位点，IPTG什么的肯定不能用。用PCR应该也可以把？问题又来了，这时的PCR所用引物可以是前面扩增基因片段的引物吗？如果可以，那么再返回前面设计引物的阶段，我这个引物要与载体上片段重合多少BP？要有游离端吗？

纠结了一晚上，依然百思不得其解，求高人指点迷津~~~~

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1楼 2010-11-09 11:06:58

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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)

应助: 4 (幼儿园)
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在线: 179.8小时
虫号: 959172

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流

你用的什么载体呀？T载体吗？我用过Promega的PGEMTeasy和TAKARA的TMD18、TMD19,是TA连接，我没管酶切位点，我设计引物时也没添加酶切位点，转化时需加IPTG和Xgal，连接上后的菌落是白色，不用酶切，直接用菌液PCR检测，引物是我的目的片段的引物，菌液PCR的结果是扩出了目的条带