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魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)


[交流] 【求助/交流】关于引物

现在,我有了载体,有了目的基因的片段。我的目的是为了把这段基因连到载体上让其表达。我想知道的是,我是否应该先大量制备这种载体和目的基因片段? 如果是,那么,载体是要通过大量摇瓶培养导入载体的菌体然后裂解获得是吗? 目的基因片段(外公司合成)是要经过PCR大量合成对吧?

问题来了,这段基因片段引物问题,我已经有了酶切位点。这段引物上有多少要与目的基因片段重合?3‘端是不是要留有一部分不与目的片段重合?这段不重合的大约要多少BP?

当我把重组子做好之后如何检验是否连接成功? 没有诱导检测位点,IPTG什么的肯定不能用。用PCR应该也可以把? 问题又来了,这时的PCR所用引物可以是前面扩增基因片段的引物吗? 如果可以,那么再返回前面设计引物的阶段,我这个引物要与载体上片段重合多少BP? 要有游离端吗?

纠结了一晚上,依然百思不得其解,求高人指点迷津~~~~
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
你用的什么载体呀?T载体吗?我用过Promega的PGEMTeasy和TAKARA的TMD18、TMD19,是TA连接,我没管酶切位点,我设计引物时也没添加酶切位点,转化时需加IPTG和Xgal,连接上后的菌落是白色,不用酶切,直接用菌液PCR检测,引物是我的目的片段的引物,菌液PCR的结果是扩出了目的条带
8楼2010-11-09 17:55:06
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小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
楼主应该好好去看一下分子克隆指南
所有的问题都可以得到解答
2楼2010-11-09 11:12:40
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shan-sa

金虫 (正式写手)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
dhd997:编辑内容 2010-11-09 12:20
问问师兄师姐的哪个不知道

[ Last edited by dhd997 on 2010-11-9 at 12:20 ]
3楼2010-11-09 11:21:47
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魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-11-09 11:12:40:
楼主应该好好去看一下分子克隆指南
所有的问题都可以得到解答

不知道这位朋友有没有看过,解释一下呗,分子克隆我看过了,没有寻着答案,我看的是零四年版本,不知这位兄台的是什么版本
4楼2010-11-09 15:42:10
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