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hzxm0316

铁虫 (初入文坛)

[求助] 转化后菌液PCR鉴定,没有目的条带

PCR时得到目的片段800bp,亮且单一,可是连接转化后,再菌液PCR鉴定,却始终只有200bp左右的条带,是怎么回事啊?有两次菌液鉴定得到800bp的单一亮条带,可是将测序结果提交到NCBI比对,却是没有找到相似序列?为什么就是转化不出目的序列呢?哪位大侠路过,请帮忙解答,谢谢!

(载体为PUCm-T Vecter;宿主为E.coli 5a)
(菌液鉴定:M13通用引物)
  实验均按照生工生物T-载体PCR产物克隆试剂盒上规定操作
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hzxm0316

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-31 06:53:28
如果分子量都不对,那我觉得是从最开始找问题应该,每一步都CHECK一下。
PCR之后,跑胶,请加MARKER标定PCR产物分子量。
回收之后,请把回收产物用2-3微升跑胶,看分子量是否正确。
如果正确,连接转化。
转化后 ...

谢谢,你的实验态度很谨慎,值得学习!可是我觉得不是分子量的问题,最后得到的200bp可能是引物二聚体,也就是说目的片段丢失,没有克隆出来
12楼2012-09-02 16:06:03
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王礼鹏

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 同意 2012-08-31 07:23:55
会不会你挑的菌是假阳性的呀,多挑几个试试,或酶切看看
2楼2012-08-30 09:58:02
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 同意 2012-08-31 07:23:22
PCR很可能扩增得到有条带的假阳性克隆,你P的同时最好做个酶切验证,验证结果一致的再测序,这样是你需要的东东的可能性就更大!
持之以恒、永不放弃!
3楼2012-08-30 10:14:59
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-30 14:47:26
如果你测序后获得800bp,但是比对没有同源性序列,说明是一个新序列。
如果测序结果只有200,只能说明你连接上的片段不对,或者是假阳性。最好,菌落PCR验证时,用通用引物和你自己的特异引物同时扩增来验证。
5楼2012-08-30 13:12:12
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