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sars37

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[求助] 转化后细菌提质粒，PCR条带很诡异

从板上挑的菌落都长的不是很好，基本上就只有几个菌落，挑完接种提质粒后PCR，发现条带只有100bp，目的基因有1000bp左右，而且还加了myc，为什么PCR之后就只有100bp了呢？

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1楼 2013-07-22 17:26:10

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xz2001199802

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sars37(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩。 2013-07-22 20:08:33

为什么不先用colony PCR确认之后，再提质粒，质粒提了之后，浓度是多少，有可能浓度高了，建议稀释一定倍数后再来PCR。并建议在质粒提取后做酶切，这样也能判断目的基因是否插入，插入方向是否正确

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越学越无知

2楼2013-07-22 19:58:03

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84146922

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sars37: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-07-23 10:43:29

估计是引物二聚体
应该是假阳性
建议菌落PCR，才接种提质粒

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3楼2013-07-22 20:48:52

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lwiaanngg

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sars37: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-07-23 10:43:21

一般来说，1kb左右的片段，连接正常转换正常的话，不应该只有几个点
结果告诉你连接不是很成功，重新做连接转化了

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4楼2013-07-22 20:48:58

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cicelyzh

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感谢参与，应助指数 +1

觉得是没有连上，重新酶切、连接、转化。

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5楼2013-07-23 00:46:11

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4楼: Originally posted by lwiaanngg at 2013-07-22 20:48:58
一般来说，1kb左右的片段，连接正常转换正常的话，不应该只有几个点
结果告诉你连接不是很成功，重新做连接转化了

你好，这个实验已经重复几次了，每次涂板后长出的菌落都不是均匀分布在板上，是集中在边缘，菌落连在一起，然后我挑的是在边缘上独立出来的几个菌落。

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6楼2013-07-23 10:41:52

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3楼: Originally posted by 84146922 at 2013-07-22 20:48:52
估计是引物二聚体
应该是假阳性
建议菌落PCR，才接种提质粒

是把菌落划一半另一半PCR吗？

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7楼2013-07-23 10:43:00

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5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-23 00:46:11
觉得是没有连上，重新酶切、连接、转化。

你好，我想请问我涂板后的菌落只是在边缘长出来，而且都连在一起，我是挑了几个独立出来的做，这种情况可能是什么问题呢？

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8楼2013-07-23 11:43:21

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追梦的人1987

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9楼2013-07-23 11:45:27

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7楼: Originally posted by sars37 at 2013-07-23 10:43:00
是把菌落划一半另一半PCR吗？...

用牙签轻轻沾点去PCR就可以了
如果怕沾多了，可以先用牙签沾到加有5微升的无菌水的灭绝PCR管内
再吸0.5微升去进行PCR

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10楼2013-07-23 12:51:50

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