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土壤真菌PCR的问题
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最近在P土壤真菌DNA，没条带，用的引物是ITS1F/ITS2 我是用周继中的方法提的DNA，测浓度（2g土差不多能提200~300 ng/ul）后稀释到 1 ng/ul 作为模板，同一份模板我在做细菌PCR时结果还行基本上都P的出来，但真菌是才开始摸索，望大家多提提建议 25ul 体系 模板 2 引物 1 水 9.5 ExTaq 12.5 PCR程序 94 ℃ for 4 min, 30 cycles of 30 s at 94 ℃, 50 ℃ for 1 min and 72 ℃ for 90 s, followed by 10 min at 72 ℃. |
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2楼2012-10-14 17:27:10
3楼2012-10-15 08:46:43
4楼2012-10-15 12:46:37
【答案】应助回帖
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小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-10-17 14:45:57
fddyn: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢啊，明天尝试提高模板浓度试试 2012-10-17 20:18:34
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-10-17 14:45:57
fddyn: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢啊，明天尝试提高模板浓度试试 2012-10-17 20:18:34
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因为这个酶我没用过，所以不好评定，如果你们实验室买东西比较自由，可以先买一只Promega的MIX试试，因为很多外文文献P土壤DNA都是用的Promega的GoTaq MIX，TAKARA的估计用于一般植物什么的基因的比较多，如果你不能换酶，把模版浓度提高，我们一般都是5——10ng/ul，然后循环增加到35——40循环，然后再试试 |
5楼2012-10-17 11:16:00
要是P不出来再上来讨论讨论，现在只是先从条件优化，要是再不出来可能就是引物的问题了 6楼2012-10-19 17:10:10
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7楼2012-11-01 09:45:45
8楼2012-11-01 19:36:49
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9楼2012-11-16 15:31:29