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fddyn

金虫 (小有名气)

[求助] 土壤真菌PCR的问题

最近在P土壤真菌DNA，没条带，用的引物是ITS1F/ITS2
我是用周继中的方法提的DNA，测浓度（2g土差不多能提200~300 ng/ul）后稀释到 1 ng/ul 作为模板，同一份模板我在做细菌PCR时结果还行基本上都P的出来，但真菌是才开始摸索，望大家多提提建议
25ul 体系
模板   2
引物   1
水     9.5
ExTaq  12.5
PCR程序
94 ℃ for 4 min, 30 cycles of 30 s at 94 ℃, 50 ℃ for 1 min and 72 ℃ for 90 s, followed by 10 min at 72 ℃.
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1楼 2012-10-14 17:24:09
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fddyn

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by fcheng025 at 2012-11-01 09:45:45
周的方法比较适合细菌，真菌估计要用玻璃珠破碎好的吧

谢谢，不知你做的是土壤真菌吗，用试剂盒提的吗？
也是这么想的，所以现在提都加sigma的玻璃珠了，但土壤腐殖酸含量实在高，现在正在尝试Qiagen家的大片段胶回收试剂盒，纠结中
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8楼2012-11-01 19:36:49
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ilyzp

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-10-14 21:11:42
你用的什么酶，我用的Promega的MIX，很好用，或者是东洋纺的KOD酶，对于P不好P的基因都很好用，因为土壤中提取的DNA有可能会有腐殖质之类的影响PCR，我用国产的MIX基本上都不怎么能P出来
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2楼2012-10-14 17:27:10
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fddyn

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ilyzp at 2012-10-14 17:27:10
你用的什么酶，我用的Promega的MIX，很好用，或者是东洋纺的KOD酶，对于P不好P的基因都很好用，因为土壤中提取的DNA有可能会有腐殖质之类的影响PCR，我用国产的MIX基本上都不怎么能P出来

师姐定的，一直也没留意，今天去看下，好像是国产的，但这个酶P细菌还行
谢谢，你的意见
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3楼2012-10-15 08:46:43
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fddyn

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ilyzp at 2012-10-14 17:27:10
你用的什么酶，我用的Promega的MIX，很好用，或者是东洋纺的KOD酶，对于P不好P的基因都很好用，因为土壤中提取的DNA有可能会有腐殖质之类的影响PCR，我用国产的MIX基本上都不怎么能P出来

刚看了下，是TAKARA Premix Ex Taq
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4楼2012-10-15 12:46:37
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