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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 如何测定样品中活体微生物数量？
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在雨中

金虫 (著名写手)

[求助] 如何测定样品中活体微生物数量？

问题如下：提取土壤等环境样品中的总DNA，采用常规的细菌或者真菌通用引物或者某种特定基因的引物进行定量PCR，那么得出来的是应该是该样品中的总物种数量。但这个数量应该也包括一些已经死亡的微生物的DNA衍生的值（死亡细胞有一部分DNA未被降解），应该不准确。
请教高手，有没有一种方法，将土壤样品中的死亡细胞中的DNA去除，然后用荧光定量PCR方法测定活体细胞的总DNA数量？谢谢。
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1楼2012-03-26 16:47:55
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回帖置顶 ( 共有2个 )

疯狂修行者

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+6, BioEPI+1, 鼓励帮助解答问题！ 2012-03-26 19:54:04
在雨中: 金币+40, ★★★很有帮助 2012-03-26 20:02:53
你利用的类似宏基因组的方法，提取土壤等环境样品中的总DNA，采用常规的细菌或者真菌通用引物或者某种特定基因的引物进行定量PCR，测定的是大部分微生物的DNA的情况。你没有必要做所谓的活细菌啊。因为：微生物的生命周期很短，你在做的时候肯定有死的有活的菌株，而你做的DNA中所包含的菌株就是反应土壤中微生物的情况啊，为什么一定要研究当时活的那一部分呢？ 除非你做的土壤要经过特殊处理，那你就知道特殊处理的针对的菌株了。那可以根据那个菌株信息进行培养实验啊。
    另外，目前可培养的微生物只是很少的一部分，还有你的方法做的也是只一部分，不可能把所有菌株做全的，这样的话，你所追求的活菌，就没有什么意义了。
    我只是根据你以上的叙述，给你回复。但是我不太明白，你为什么要做土壤中，活细菌的数量？你的实验想得到什么方面的结果呢？你要干什么事情呢？按照你所说，你得到的活菌的情况要干什么呢？
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2楼2012-03-26 17:17:11
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在雨中

金虫 (著名写手)
在雨中: 回帖置顶 2012-03-26 20:08:26
引用回帖:
3楼: Originally posted by 疯狂修行者 at 2012-03-26 17:29:44:
还有，对于活细菌，有相应的方法。
第一，利用相应培养基进行培养，但是能培养的细菌其实在很少，如果进行培养，将有大部分菌株丢失。
第二，利用活细菌检测试纸，这个你管公司问就可以，在微生物实验里很普遍的 ...

我的意思是，参与土壤活性的微生物，比如细菌，在特定样品和特定时间，它的活性细菌总数（活着的）是一定的。我们常规提取总DNA，然后用通用引物定量PCR，得出的值并不准确。因为提取的总DNA中肯定有一部分是已经死亡的细胞释放出来的未被降解的DNA，这样在一定程度上夸大了荧光定量PCR值。您觉得呢？
我只是想找出一种方法，将土壤样品中的死亡细胞中的DNA去除，再用常规的DNA提取和定量PCR来确定样品中的细菌总数。这样得出的值，可以算是活细胞数量。
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5楼2012-03-26 20:08:22
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疯狂修行者

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
amisking: 金币+3, 鼓励帮助解答问题！ 2012-03-26 19:54:13
还有，对于活细菌，有相应的方法。
第一，利用相应培养基进行培养，但是能培养的细菌其实在很少，如果进行培养，将有大部分菌株丢失。
第二，利用活细菌检测试纸，这个你管公司问就可以，在微生物实验里很普遍的。
但是最关键的是，你要搞清楚自己要干什么？要哪些结果？为什么要这些结果？根据哪些结果可以得到哪些结论？有些实验考虑会是多余的。
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3楼2012-03-26 17:29:44
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疯狂修行者

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
在雨中: 金币+40, ★★★很有帮助, 高手！ 2012-03-26 22:15:38
引用回帖:
5楼: Originally posted by 在雨中 at 2012-03-26 20:08:22:
我的意思是，参与土壤活性的微生物，比如细菌，在特定样品和特定时间，它的活性细菌总数（活着的）是一定的。我们常规提取总DNA，然后用通用引物定量PCR，得出的值并不准确。因为提取的总DNA中肯定有一部分是已经 ...

我感觉你的这个考虑是多余的。
    你的荧光定量是相对定量，还是绝对定量啊？不管是相对定量还是绝对定量，都是拿来比较，说是定量，但也是在一定条件下的相对比较。根据CT值或相对的CT值来进行比较，找规律。实验中有死菌还是没有死菌，都是反应了菌的相对量。但也不能你跟菌这个相对量说，某个菌多多少，只能说相对多多少。并不能根据已有的CT值或相对的CT值计算或得到相应菌量。
    如果你有要定的菌的信息，我建议，你跟菌该菌的信息去做，可能会好些。要是只是根据总DNA做的总体的PCR，我觉得那就没必要取出什么死菌了。这里的误差都会大雨你所谓去除的死菌的数量。
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6楼2012-03-26 22:04:29
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在雨中

金虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 疯狂修行者 at 2012-03-26 22:04:29:
我感觉你的这个考虑是多余的。
    你的荧光定量是相对定量，还是绝对定量啊？不管是相对定量还是绝对定量，都是拿来比较，说是定量，但也是在一定条件下的相对比较。根据CT值或相对的CT值来进行比较，找规律。 ...

恩。感谢您的辛苦回复。我刚才查阅了文献，确实有不少介绍用不同方法去除样品中死亡细胞DNA的方法，然后采用定量PCR（绝对）测定特定菌种的数量。我觉得，在某些特定环境体系，细胞更新换代很快，样品中有不可低估的死亡细胞DNA存在，对我们分析数据造成了一定的误差干扰。
呵呵。再次感谢 疯狂修行者 虫虫！
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7楼2012-03-26 22:15:05
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普通回帖

在雨中

金虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 疯狂修行者 at 2012-03-26 17:17:11:
你利用的类似宏基因组的方法，提取土壤等环境样品中的总DNA，采用常规的细菌或者真菌通用引物或者某种特定基因的引物进行定量PCR，测定的是大部分微生物的DNA的情况。你没有必要做所谓的活细菌啊。因为：微生物的 ...

您是高手！感谢您的回复。
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4楼2012-03-26 20:02:17
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见神一笑

木虫 (著名写手)
楼主的这个问题我也很感兴趣，开题的时候就被问到了这个问题。楼主能不能把这些去除死菌DNA的文献发给我？我是邮箱是jianwuxiaoxiang@yeah.net,非常感谢
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好好努力
8楼2012-03-29 12:35:57
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在雨中

金虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 见神一笑 at 2012-03-29 12:35:57:
楼主的这个问题我也很感兴趣，开题的时候就被问到了这个问题。楼主能不能把这些去除死菌DNA的文献发给我？我是邮箱是jianwuxiaoxiang@yeah.net,非常感谢

呵呵。中南大学生物冶金的朋友？
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9楼2012-03-29 14:06:13
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见神一笑

木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 在雨中 at 2012-03-29 14:06:13:
呵呵。中南大学生物冶金的朋友？

你是怎么知道的？
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好好努力
10楼2012-03-30 08:36:22
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