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碧海行帆

金虫 (初入文坛)

[求助] 真菌转化子PCR验证问题

跟大家探讨一个问题,我做真菌的基因敲除,目前得到了24个转化子,进行PCR验证的时候,抗性基因也就是阳性对照成功扩出,要敲除的目的基因都没有扩出,按理说应该是都敲除了,但转化率达到了100%,大家说有这种可能吗???
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硕士毕业去找工作
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碧海行帆

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-06 02:27:42
如果有抗性基因而要敲除的基因还在的话才有问题,那说明不能用抗性基因来筛选目的基因了。此外,我觉得你最好不要用PCR负结果来证明敲除基因不在了,应该用敲除基因序列两端的DNA序列做PCR,确定突变株的带(含抗性 ...

嗯,有道理,我用敲除基因序列两端的DNA序列做PCR验证了,但结果是非特异性条带,没有单一的条带,而且目的基因扩增了很多次均为扩出,所以说我现在很疑惑啊
硕士毕业去找工作
5楼2013-01-06 11:46:15
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
碧海行帆: 金币+1 2013-01-07 10:45:31
你用抗性做筛选标记,假的都死了,出来假的才不对吧。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
2楼2013-01-05 20:36:31
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
碧海行帆: 金币+4 2013-01-07 10:46:10
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-07 16:51:20
如果有抗性基因而要敲除的基因还在的话才有问题,那说明不能用抗性基因来筛选目的基因了。此外,我觉得你最好不要用PCR负结果来证明敲除基因不在了,应该用敲除基因序列两端的DNA序列做PCR,确定突变株的带(含抗性基因)位置和野生型不同,并且不含野生型的带。
3楼2013-01-06 02:27:42
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碧海行帆

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2013-01-05 20:36:31
你用抗性做筛选标记,假的都死了,出来假的才不对吧。

嗯,但也有抗性基因转进去了,目的基因没转进去的情况啊
硕士毕业去找工作
4楼2013-01-06 11:43:47
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