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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】土壤真菌PCR
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wuzunfeng416

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】土壤真菌PCR 已有6人参与

最近再批土壤真菌，没条带，望大家提提建议，用的引物是NS1F和NS8R
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1楼 2011-03-15 14:08:23
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allica

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
条带不好原因挺多的，首先检查你的基因组DNA质量。然后就是你的PCR模板量和PCR程序调整。可以做个退火温度梯度的实验。
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2楼2011-03-15 15:41:56
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精精

金虫 (小有名气)
★
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Originally posted by wuzunfeng416 at 2011-03-15 14:08:23:
最近再批土壤真菌，没条带，望大家提提建议，用的引物是NS1F和NS8R

用这对引物扩真菌好像问题是挺多的，但是好像好是能够扩出来的，再尝试试试~~
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少才微善
3楼2011-03-17 16:49:24
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syw2005

铁杆木虫 (小有名气)
我用的ITS1和ITS4，第一次能扩出来，后来再也扩不出来，不知为何？试了好多条件都不行？难，我从模板、引物、酶都摸了，还是不行。不过有一些可以定下来，模板有抑制物。多试才有经验。
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新疆胡杨
4楼2011-08-01 22:10:48
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jinkui960

至尊木虫 (知名作家)
★
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4楼: Originally posted by syw2005 at 2011-08-01 22:10:48:
我用的ITS1和ITS4，第一次能扩出来，后来再也扩不出来，不知为何？试了好多条件都不行？难，我从模板、引物、酶都摸了，还是不行。不过有一些可以定下来，模板有抑制物。多试才有经验。

我觉得可能是模板的问题，如果模板有抑制物的话，可以稀释看看，祝好运！
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5楼2011-08-02 09:12:31
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bear0329

金虫 (正式写手)
★
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我提的土壤DNA，细菌的16sDNA可以很好的扩增出来，带很亮。但是真菌的ITS序列就是很淡，体系和条件都优化了，都不行哦，还是很淡。纠结中，还请高手指点。我用的是ITS1/ITS4这对引物。谢谢啦
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以马内利！
6楼2011-08-03 10:07:31
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biocontrol

金虫 (小有名气)
★
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换个引物看看，NS1和fungi扩增效果还可以。ITS1和4扩增不行的可以换成它
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裸奔进行时...
7楼2011-08-03 11:05:46
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hc1027

木虫 (正式写手)
★
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6楼: Originally posted by bear0329 at 2011-08-03 10:07:31:
我提的土壤DNA，细菌的16sDNA可以很好的扩增出来，带很亮。但是真菌的ITS序列就是很淡，体系和条件都优化了，都不行哦，还是很淡。纠结中，还请高手指点。我用的是ITS1/ITS4这对引物。谢谢啦

请问你是用的什么方法提的土壤DNA呢？AEM的那篇蛋白酶K+CTAB法吗？
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8楼2011-08-04 15:27:54
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bear0329

金虫 (正式写手)
★
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8楼: Originally posted by hc1027 at 2011-08-04 15:27:54:
请问你是用的什么方法提的土壤DNA呢？AEM的那篇蛋白酶K+CTAB法吗？

恩啊，DNA还是很好提的
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以马内利！
9楼2011-08-04 16:35:55
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hc1027

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by bear0329 at 2011-08-04 16:35:55:
恩啊，DNA还是很好提的

我也提了好几次，效果总是不好，有时根本提不出来。
想请教下细节方面，希望指点：
1、加氯仿异戊醇后混匀是涡旋还是轻轻颠倒混匀，涡旋会使DNA断裂吗？离心速度和时间是多少？
2、70%乙醇洗沉淀如何进行？是直接加到沉淀中后马上就倒掉，还是加了之后轻轻混合然后离心再吸走上清液，离心速度及时间是多少？
3、洗沉淀后一般如何干燥？发现我的样经常风干10多分钟也没见干，请问你是怎么做的呢？
4、用TE或者ddH2O溶解DNA的问题：是直接加进去放置一会就行了，还是要50度左右水浴下呢？还是4度放置过夜之类的？
O(∩_∩)O谢谢
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10楼2011-08-04 21:21:34
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