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1楼2011-03-15 14:08:23

allica

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条带不好原因挺多的，首先检查你的基因组DNA质量。然后就是你的PCR模板量和PCR程序调整。可以做个退火温度梯度的实验。

2楼2011-03-15 15:41:56

精精

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Originally posted by wuzunfeng416 at 2011-03-15 14:08:23:
最近再批土壤真菌，没条带，望大家提提建议，用的引物是NS1F和NS8R

用这对引物扩真菌好像问题是挺多的，但是好像好是能够扩出来的，再尝试试试~~

少才微善

3楼2011-03-17 16:49:24

syw2005

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我用的ITS1和ITS4，第一次能扩出来，后来再也扩不出来，不知为何？试了好多条件都不行？难，我从模板、引物、酶都摸了，还是不行。不过有一些可以定下来，模板有抑制物。多试才有经验。

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新疆胡杨

4楼2011-08-01 22:10:48

jinkui960

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4楼: Originally posted by syw2005 at 2011-08-01 22:10:48:
我用的ITS1和ITS4，第一次能扩出来，后来再也扩不出来，不知为何？试了好多条件都不行？难，我从模板、引物、酶都摸了，还是不行。不过有一些可以定下来，模板有抑制物。多试才有经验。

我觉得可能是模板的问题，如果模板有抑制物的话，可以稀释看看，祝好运！

5楼2011-08-02 09:12:31

bear0329

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我提的土壤DNA，细菌的16sDNA可以很好的扩增出来，带很亮。但是真菌的ITS序列就是很淡，体系和条件都优化了，都不行哦，还是很淡。纠结中，还请高手指点。我用的是ITS1/ITS4这对引物。谢谢啦

以马内利！

6楼2011-08-03 10:07:31

biocontrol

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换个引物看看，NS1和fungi扩增效果还可以。ITS1和4扩增不行的可以换成它

裸奔进行时...

7楼2011-08-03 11:05:46

hc1027

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6楼: Originally posted by bear0329 at 2011-08-03 10:07:31:
我提的土壤DNA，细菌的16sDNA可以很好的扩增出来，带很亮。但是真菌的ITS序列就是很淡，体系和条件都优化了，都不行哦，还是很淡。纠结中，还请高手指点。我用的是ITS1/ITS4这对引物。谢谢啦

请问你是用的什么方法提的土壤DNA呢？AEM的那篇蛋白酶K+CTAB法吗？

8楼2011-08-04 15:27:54

bear0329

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8楼: Originally posted by hc1027 at 2011-08-04 15:27:54:
请问你是用的什么方法提的土壤DNA呢？AEM的那篇蛋白酶K+CTAB法吗？

恩啊，DNA还是很好提的

以马内利！

9楼2011-08-04 16:35:55

hc1027

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9楼: Originally posted by bear0329 at 2011-08-04 16:35:55:
恩啊，DNA还是很好提的

我也提了好几次，效果总是不好，有时根本提不出来。
想请教下细节方面，希望指点：
1、加氯仿异戊醇后混匀是涡旋还是轻轻颠倒混匀，涡旋会使DNA断裂吗？离心速度和时间是多少？
2、70%乙醇洗沉淀如何进行？是直接加到沉淀中后马上就倒掉，还是加了之后轻轻混合然后离心再吸走上清液，离心速度及时间是多少？
3、洗沉淀后一般如何干燥？发现我的样经常风干10多分钟也没见干，请问你是怎么做的呢？
4、用TE或者ddH2O溶解DNA的问题：是直接加进去放置一会就行了，还是要50度左右水浴下呢？还是4度放置过夜之类的？
O(∩_∩)O谢谢

10楼2011-08-04 21:21:34