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wuzunfeng416

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】土壤真菌PCR 已有6人参与

最近再批土壤真菌,没条带,望大家提提建议,用的引物是NS1F和NS8R
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allica

新虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
条带不好原因挺多的,首先检查你的基因组DNA质量。然后就是你的PCR模板量和PCR程序调整。可以做个退火温度梯度的实验。
2楼2011-03-15 15:41:56
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精精

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by wuzunfeng416 at 2011-03-15 14:08:23:
最近再批土壤真菌,没条带,望大家提提建议,用的引物是NS1F和NS8R

用这对引物扩真菌好像问题是挺多的,但是好像好是能够扩出来的,再尝试试试~~
少才微善
3楼2011-03-17 16:49:24
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syw2005

铁杆木虫 (小有名气)

我用的ITS1和ITS4,第一次能扩出来,后来再也扩不出来,不知为何?试了好多条件都不行?难,我从模板、引物、酶都摸了,还是不行。不过有一些可以定下来,模板有抑制物。多试才有经验。
新疆胡杨
4楼2011-08-01 22:10:48
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jinkui960

至尊木虫 (知名作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
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4楼: Originally posted by syw2005 at 2011-08-01 22:10:48:
我用的ITS1和ITS4,第一次能扩出来,后来再也扩不出来,不知为何?试了好多条件都不行?难,我从模板、引物、酶都摸了,还是不行。不过有一些可以定下来,模板有抑制物。多试才有经验。

我觉得可能是模板的问题,如果模板有抑制物的话,可以稀释看看,祝好运!
5楼2011-08-02 09:12:31
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bear0329

金虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
我提的土壤DNA,细菌的16sDNA可以很好的扩增出来,带很亮。但是真菌的ITS序列就是很淡,体系和条件都优化了,都不行哦,还是很淡。纠结中,还请高手指点。我用的是ITS1/ITS4这对引物。谢谢啦
以马内利!
6楼2011-08-03 10:07:31
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biocontrol

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
换个引物看看,NS1和fungi扩增效果还可以。ITS1和4扩增不行的可以换成它
裸奔进行时...
7楼2011-08-03 11:05:46
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hc1027

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by bear0329 at 2011-08-03 10:07:31:
我提的土壤DNA,细菌的16sDNA可以很好的扩增出来,带很亮。但是真菌的ITS序列就是很淡,体系和条件都优化了,都不行哦,还是很淡。纠结中,还请高手指点。我用的是ITS1/ITS4这对引物。谢谢啦

请问你是用的什么方法提的土壤DNA呢?AEM的那篇蛋白酶K+CTAB法吗?
8楼2011-08-04 15:27:54
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bear0329

金虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by hc1027 at 2011-08-04 15:27:54:
请问你是用的什么方法提的土壤DNA呢?AEM的那篇蛋白酶K+CTAB法吗?

恩啊,DNA还是很好提的
以马内利!
9楼2011-08-04 16:35:55
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hc1027

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by bear0329 at 2011-08-04 16:35:55:
恩啊,DNA还是很好提的

我也提了好几次,效果总是不好,有时根本提不出来。
想请教下细节方面,希望指点:
1、加氯仿异戊醇后混匀是涡旋还是轻轻颠倒混匀,涡旋会使DNA断裂吗?离心速度和时间是多少?
2、70%乙醇洗沉淀如何进行?是直接加到沉淀中后马上就倒掉,还是加了之后轻轻混合然后离心再吸走上清液,离心速度及时间是多少?
3、洗沉淀后一般如何干燥?发现我的样经常风干10多分钟也没见干,请问你是怎么做的呢?
4、用TE或者ddH2O溶解DNA的问题:是直接加进去放置一会就行了,还是要50度左右水浴下呢?还是4度放置过夜之类的?
O(∩_∩)O谢谢
10楼2011-08-04 21:21:34
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