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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 真菌转化子PCR验证问题
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碧海行帆

金虫 (初入文坛)

[求助] 真菌转化子PCR验证问题

跟大家探讨一个问题，我做真菌的基因敲除，目前得到了24个转化子，进行PCR验证的时候，抗性基因也就是阳性对照成功扩出，要敲除的目的基因都没有扩出，按理说应该是都敲除了，但转化率达到了100%，大家说有这种可能吗？？？
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1楼2013-01-05 17:35:48
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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碧海行帆: 金币+4 2013-01-07 10:46:10
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-07 16:51:20
如果有抗性基因而要敲除的基因还在的话才有问题，那说明不能用抗性基因来筛选目的基因了。此外，我觉得你最好不要用PCR负结果来证明敲除基因不在了，应该用敲除基因序列两端的DNA序列做PCR，确定突变株的带（含抗性基因）位置和野生型不同，并且不含野生型的带。
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3楼2013-01-06 02:27:42
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 碧海行帆 at 2013-01-06 11:46:15
嗯，有道理，我用敲除基因序列两端的DNA序列做PCR验证了，但结果是非特异性条带，没有单一的条带，而且目的基因扩增了很多次均为扩出，所以说我现在很疑惑啊...

你说的非特异条带是在野生型还是突变株里扩出来的？是引物的问题吗？你敲除的目的基因是否有其它同源基因呢？
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8楼2013-01-06 13:58:21
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by 碧海行帆 at 2013-01-06 18:02:56
非特异性带是突变株扩出来的，是做上下游验证用的，不是扩目的基因，引物换过了，还是一样啊。...

你是说野生型是单一条带，但突变株是很多杂带？杂带中有野生型的条带吗？上个图分析一下吧。
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12楼2013-01-07 02:42:44
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by 碧海行帆 at 2013-01-07 09:05:44
12.11.26(zhuanhuazi xiayou yanzheng-2).jpg(14.74KB)
http://kuai.xunlei.com/d/LnU4Dfbg2B3qUAQA2e6?p=130497
第一道为mark 第2道到第6道为5个转化子做下游验证，最亮的和我要的目的带大小类似，但杂带很多， ...

没有野生对照吗？这些杂带包括野生的带么？还有我怀疑你PCR时候的模板量太大，所以特异性不行。你用了多少DNA模板？
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14楼2013-01-07 11:22:56
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
碧海行帆: 金币+1 2013-01-08 14:59:38
引用回帖:
15楼: Originally posted by 碧海行帆 at 2013-01-07 14:47:12
第六道为野生型，最亮的带应该符合下游验证的大小，DNA的浓度都是提完后，加30-100ul，用的时候再稀释10倍，以前都是这么做的啊，能留下QQ进步交流下吗...

野生型的带也杂，确定引物没问题吗？是否优化了退火温度？模板最好做个定量，上100ng左右PCR。不要超过500ng。如果你不能定量，可以做几个稀释不同的模板浓度，试试看能不能去掉杂带。
PS: 我不用QQ的。
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16楼2013-01-08 08:15:37
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