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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】pET29a转化E.coli BL21
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xiaoyu1014126

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】pET29a转化E.coli BL21

刚刚入手异源表达，将目的基因片段连接到pET29a质粒上，是直接转化到E.coli BL21中呢，还是先转化到DH5a中，提取质粒，再转化BL21中呢！
请高手指导下！！
谢谢！
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1楼 2011-04-03 11:33:49
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★
1949stone(金币+2, EPI+1): 鼓励 2011-04-03 13:04:29
DH5α有DNA酶缺陷，适合用于克隆（质粒DNA不容易被干掉，可以过量复制），BL21貌似是有蛋白酶缺陷，适合用于表达。

酶切、连接之后，不能保证片段一定连上去，所以需要一个验证的过程，这就需要提质粒。所以先把连接产物转化到DH5α，挑选单菌落，然后验证。

就是说，如果你需要把外源片段插入质粒里，那在酶切、连接之后，先把重组质粒转化到DH5α里面，然后筛选转化子（例如，提质粒后酶切验证、PCR验证等等）；筛选到含有正确的重组质粒的转化子后，再摇菌，把重组质粒提出来，转化到BL21里面，用于诱导表达蛋白质。

下面是抄来的，我自己也没全看懂……
1：DH5α菌株
DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。

基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1

2：BL21(DE3) 菌株

该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。

基因型：F-，ompT， hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3）
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2楼2011-04-03 12:52:30
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td0605

木虫 (著名写手)
BL21是用于表达的，应当先转到DH5α里，测序验证读码框正确，再摇菌提质粒转BL21!

[ Last edited by td0605 on 2011-4-3 at 13:38 ]
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3楼2011-04-03 13:35:38
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-04-04 08:33:02
其实都可以的，表达宿主也可以测序的，只不过我们的习惯是先转克隆宿主，再表达宿主。
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4楼2011-04-03 22:45:07
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-04-03 22:45:07:
其实都可以的，表达宿主也可以测序的，只不过我们的习惯是先转克隆宿主，再表达宿主。

支持楼上！
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5楼2011-04-03 23:35:00
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