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【求助/交流】pET29a转化E.coli BL21
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刚刚入手异源表达，将目的基因片段连接到pET29a质粒上，是直接转化到E.coli BL21中呢，还是先转化到DH5a中，提取质粒，再转化BL21中呢！ 请高手指导下！！ 谢谢！ |
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1949stone(金币+2, EPI+1): 鼓励 2011-04-03 13:04:29
1949stone(金币+2, EPI+1): 鼓励 2011-04-03 13:04:29
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DH5α有DNA酶缺陷，适合用于克隆（质粒DNA不容易被干掉，可以过量复制），BL21貌似是有蛋白酶缺陷，适合用于表达。 酶切、连接之后，不能保证片段一定连上去，所以需要一个验证的过程，这就需要提质粒。所以先把连接产物转化到DH5α，挑选单菌落，然后验证。 就是说，如果你需要把外源片段插入质粒里，那在酶切、连接之后，先把重组质粒转化到DH5α里面，然后筛选转化子（例如，提质粒后酶切验证、PCR验证等等）；筛选到含有正确的重组质粒的转化子后，再摇菌，把重组质粒提出来，转化到BL21里面，用于诱导表达蛋白质。 下面是抄来的，我自己也没全看懂…… 1：DH5α菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT， hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3） |
2楼2011-04-03 12:52:30
3楼2011-04-03 13:35:38
4楼2011-04-03 22:45:07
blackrose8089
铁杆木虫 (职业作家)
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5楼2011-04-03 23:35:00
