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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】提取大肠杆菌中异源表达的蛋白用什么方法
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xiaoyu1014126

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】提取大肠杆菌中异源表达的蛋白用什么方法

质粒是pET29a，宿主菌是E.coli BL21(DE3)，抗生素是kan。
请问各位高手，转化后的阳性转化子，液体培养后，用什么方法提取大肠的总蛋白以供SDS-PAGE检测呢？
1.100℃煮沸后离心？
2.超声波破碎后离心？
3.细菌蛋白提取试剂盒？
请各位过来人不吝赐教，麻烦方法告知的详细点啊，小弟刚接触这行，在此膜拜了！
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1楼 2011-04-09 10:14:59
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
xiaoyu1014126(金币+2): 2011-04-09 10:30:27
引用回帖:
Originally posted by xiaoyu1014126 at 2011-04-09 10:14:59:
质粒是pET29a，宿主菌是E.coli BL21(DE3)，抗生素是kan。
请问各位高手，转化后的阳性转化子，液体培养后，用什么方法提取大肠的总蛋白以供SDS-PAGE检测呢？
1.100℃煮沸后离心？
2.超声波破碎后离心？
3.细菌 ...

如果只是为了电泳，不需要特别提取的，直接离心收集菌体，加入上样buffer煮沸5min，然后离心，取上清去上样就是。
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2楼2011-04-09 10:27:43
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郝钊

金虫 (小有名气)
xiaoyu1014126(金币+1): 2011-04-09 12:52:17
我们将培养好的菌体浓缩一下超声破碎，离心后取上清，加入loading buffer就可以跑PAGE了
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3楼2011-04-09 11:35:22
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Youngchsh

木虫 (正式写手)
xiaoyu1014126(金币+1): 2011-04-09 12:52:24
表达的时候加个尾巴，然后超声过镍柱
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4楼2011-04-09 12:51:58
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)
xiaoyu1014126(金币+1): 2011-04-12 14:07:05
要是只用来做SDS-PAGE的话
直接收集菌体
SDS煮沸破裂
加上loading buffer开跑就OK了
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5楼2011-04-09 15:51:37
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zhyzx

金虫 (小有名气)
同意楼上观点，做的时候，做个对照
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6楼2011-04-09 15:53:58
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xujian568

至尊木虫 (著名写手)
主要是看你的下一步的目的。一般说来，只想检测表达的话。同意以上大牛的观点，都可以。
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7楼2011-04-09 16:00:18
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