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zd0017

铁虫 (小有名气)

[求助] 为什么扩了一个抗性基因，连到载体上，这个基因没有表达呢，跪求各个大牛指导！！！

最近从载体pEGFP-C3上扩neo基因，再连到pMD18-T载体上，但没有neo抗性，请大牛指导下哪里出了问题，经测序，没有突变！！！小菜一枚在这里先谢谢各位牛人啦！！！
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1楼 2013-05-22 20:19:06
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回帖置顶 ( 共有1个 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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zd0017(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-24 03:08:50
gyesang: 回帖置顶 2013-05-24 03:08:58
新霉素抗性基因是真核表达载体的一种筛选marker，neo基因编码新霉素磷酸转移酶，通过对G418、新霉素和卡那霉素磷酸化来降解抗生素儿实验抗性的。在原核生物宿主里应该用卡那霉素筛选。
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3楼2013-05-23 02:45:49
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

Renavatio

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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zd0017(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-24 03:09:20
amp平板上长是因为pMD18-T细菌中抗性就是ampR.你所扩增的NEO表达框中启动子为真核生物的启动子，在大肠杆菌中是不会启动下游基因的表达，故不会表达NEO/kana抗性
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Undefined！
8楼2013-05-23 22:44:22
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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zd0017(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-22 21:58:12
pEGFP-C3是个真核表达载体，pMD18-T是个原核载体吧？真核和原核的表达调控元件是完全不同的。
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2楼2013-05-22 21:16:11
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zd0017

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-23 02:45:49
新霉素抗性基因是真核表达载体的一种筛选marker，neo基因编码新霉素磷酸转移酶，通过对G418、新霉素和卡那霉素磷酸化来降解抗生素儿实验抗性的。在原核生物宿主里应该用卡那霉素筛选。

谢谢你的回复，也用了kana抗性的筛了，也没克隆长出啊，不知道什么原因啊
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4楼2013-05-23 11:22:41
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zd0017

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 酶切专家 at 2013-05-22 21:16:11
pEGFP-C3是个真核表达载体，pMD18-T是个原核载体吧？真核和原核的表达调控元件是完全不同的。

谢谢你的指导，但是我把pEGFP-C3这个载体转到大肠杆菌中是是可以进行kana抗性筛选的，我扩这个抗性基因是把它的调控序列什么的都扩下来了啊，不知道为什么不行？？
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5楼2013-05-23 11:25:30
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by zd0017 at 2013-05-23 11:22:41
谢谢你的回复，也用了kana抗性的筛了，也没克隆长出啊，不知道什么原因啊...

会不会是连接转化的问题？
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6楼2013-05-23 13:03:15
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zd0017

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-23 13:03:15
会不会是连接转化的问题？...

转化时分别涂了amp、kana、neo抗性的板个一个，只有amp的长出了克隆，送去测序结果是正确的，但是就是没有表达kana/neo抗性,如果这一步不行的话，我下面要构建载体做敲除岂不是也不行了！！
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7楼2013-05-23 13:35:40
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木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
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zd0017(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-24 03:09:28
看了载体图谱,有两个启动子控制卡那抗性基因的,所以整个质粒在大肠杆菌和真核细胞都有抗性,至于你克隆的,不知道包括到哪些启动子序列,如果没有原核生物中起作用的启动子,估计就没有表达抗性基因了,或者你降低抗生素浓度试试,说不定有底水平的表达.
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为什么
9楼2013-05-23 23:04:29
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
zd0017(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-24 03:09:41
引用回帖:
7楼: Originally posted by zd0017 at 2013-05-23 13:35:40
转化时分别涂了amp、kana、neo抗性的板个一个，只有amp的长出了克隆，送去测序结果是正确的，但是就是没有表达kana/neo抗性,如果这一步不行的话，我下面要构建载体做敲除岂不是也不行了！！...

你再检查一下克隆的序列是否包括了原核的启动子。如果你要做的敲除实验是在真核生物里面，只需要包括真核的启动子就可以了。
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10楼2013-05-23 23:26:10
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