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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 为什么扩了一个抗性基因，连到载体上，这个基因没有表达呢，跪求各个大牛指导！！！
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zd0017

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Renavatio at 2013-05-23 22:44:22
amp平板上长是因为pMD18-T细菌中抗性就是ampR.你所扩增的NEO表达框中启动子为真核生物的启动子，在大肠杆菌中是不会启动下游基因的表达，故不会表达NEO/kana抗性

谢谢您的指导，刚比对了下，真的没有把ampR的启动子给扩下来，我是要构建载体，在原核生物中做敲除的，那就要重新克隆这个抗性基因了，想再请教那您一下，如果要重新扩的话，这个基因后面的终止密码子以后也要多扩点吗，还是只要把终止密码子包括进去就行了呢？
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11楼2013-05-24 10:07:32
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zd0017

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 547star at 2013-05-23 23:04:29
看了载体图谱,有两个启动子控制卡那抗性基因的,所以整个质粒在大肠杆菌和真核细胞都有抗性,至于你克隆的,不知道包括到哪些启动子序列,如果没有原核生物中起作用的启动子,估计就没有表达抗性基因了,或者你降低抗生素 ...

谢谢指教，看了下我克隆的序列，的确没有吧原核生物起作用的启动子ampR promoter 给克隆下来，之前完全没有看到想到这一层，学习啦
还想问一下，载体pMD18-t中也有ampR promoter 这个启动子，如果我是正向插入的话，能否共用这个启动子呢
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12楼2013-05-24 10:12:30
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zd0017

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-23 23:26:10
你再检查一下克隆的序列是否包括了原核的启动子。如果你要做的敲除实验是在真核生物里面，只需要包括真核的启动子就可以了。...

谢谢指教，重新看了下克隆的序列，真的没有包括原核启动子，我要做的敲除是在原核生物里面，估计要重新做了。
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13楼2013-05-24 10:16:32
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
13楼: Originally posted by zd0017 at 2013-05-24 10:16:32
谢谢指教，重新看了下克隆的序列，真的没有包括原核启动子，我要做的敲除是在原核生物里面，估计要重新做了。...

好像只有重新克隆了。
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14楼2013-05-24 11:04:04
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547star

木虫 (著名写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by zd0017 at 2013-05-24 10:12:30
谢谢指教，看了下我克隆的序列，的确没有吧原核生物起作用的启动子ampR promoter 给克隆下来，之前完全没有看到想到这一层，学习啦
还想问一下，载体pMD18-t中也有ampR promoter 这个启动子，如果我是正向插入的话 ...

在终止子前能找到合适的插入位点，可以考虑共用。
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为什么
15楼2013-05-24 11:38:52
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Renavatio

木虫 (小有名气)
建议找个含有Kan抗性的原核表达载体  扩增其Kan抗性基因比较方便
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Undefined！
16楼2013-05-24 23:35:55
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zd0017

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by Renavatio at 2013-05-24 23:35:55
建议找个含有Kan抗性的原核表达载体  扩增其Kan抗性基因比较方便

谢谢！！
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17楼2013-05-25 18:01:27
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whatsao

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Renavatio at 2013-05-23 22:44:22
amp平板上长是因为pMD18-T细菌中抗性就是ampR.你所扩增的NEO表达框中启动子为真核生物的启动子，在大肠杆菌中是不会启动下游基因的表达，故不会表达NEO/kana抗性

其实，楼主将基因插在了MCS中，而MCS在乳糖启动子之下，按理说是可以转录的。
但要注意的一点是虽然乳糖启动子可以转录，但插入的序列在MCS中，而不是紧挨着启动子的，即可能会乱码，毕竟不一定是3个碱基的整数。
所以，就算转录了，也可能是乱码，故表现不出看阿霉素的抗性。
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18楼2017-04-06 19:20:56
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