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zd0017

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by Renavatio at 2013-05-23 22:44:22
amp平板上长是因为pMD18-T细菌中抗性就是ampR.你所扩增的NEO表达框中启动子为真核生物的启动子,在大肠杆菌中是不会启动下游基因的表达,故不会表达NEO/kana抗性

谢谢您的指导,刚比对了下,真的没有把ampR的启动子给扩下来,我是要构建载体,在原核生物中做敲除的,那就要重新克隆这个抗性基因了,想再请教那您一下,如果要重新扩的话,这个基因后面的终止密码子以后也要多扩点吗,还是只要把终止密码子包括进去就行了呢?
11楼2013-05-24 10:07:32
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zd0017

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 547star at 2013-05-23 23:04:29
看了载体图谱,有两个启动子控制卡那抗性基因的,所以整个质粒在大肠杆菌和真核细胞都有抗性,至于你克隆的,不知道包括到哪些启动子序列,如果没有原核生物中起作用的启动子,估计就没有表达抗性基因了,或者你降低抗生素 ...

谢谢指教,看了下我克隆的序列,的确没有吧原核生物起作用的启动子ampR promoter 给克隆下来,之前完全没有看到想到这一层,学习啦
还想问一下,载体pMD18-t中也有ampR promoter 这个启动子,如果我是正向插入的话,能否共用这个启动子呢
12楼2013-05-24 10:12:30
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zd0017

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-23 23:26:10
你再检查一下克隆的序列是否包括了原核的启动子。如果你要做的敲除实验是在真核生物里面,只需要包括真核的启动子就可以了。...

谢谢指教,重新看了下克隆的序列,真的没有包括原核启动子,我要做的敲除是在原核生物里面,估计要重新做了。
13楼2013-05-24 10:16:32
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
13楼: Originally posted by zd0017 at 2013-05-24 10:16:32
谢谢指教,重新看了下克隆的序列,真的没有包括原核启动子,我要做的敲除是在原核生物里面,估计要重新做了。...

好像只有重新克隆了。
14楼2013-05-24 11:04:04
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547star

木虫 (著名写手)

引用回帖:
12楼: Originally posted by zd0017 at 2013-05-24 10:12:30
谢谢指教,看了下我克隆的序列,的确没有吧原核生物起作用的启动子ampR promoter 给克隆下来,之前完全没有看到想到这一层,学习啦
还想问一下,载体pMD18-t中也有ampR promoter 这个启动子,如果我是正向插入的话 ...

在终止子前能找到合适的插入位点,可以考虑共用。
为什么
15楼2013-05-24 11:38:52
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Renavatio

木虫 (小有名气)

建议找个含有Kan抗性的原核表达载体  扩增其Kan抗性基因比较方便
Undefined!
16楼2013-05-24 23:35:55
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zd0017

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
16楼: Originally posted by Renavatio at 2013-05-24 23:35:55
建议找个含有Kan抗性的原核表达载体  扩增其Kan抗性基因比较方便

谢谢!!
17楼2013-05-25 18:01:27
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whatsao

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by Renavatio at 2013-05-23 22:44:22
amp平板上长是因为pMD18-T细菌中抗性就是ampR.你所扩增的NEO表达框中启动子为真核生物的启动子,在大肠杆菌中是不会启动下游基因的表达,故不会表达NEO/kana抗性

其实,楼主将基因插在了MCS中,而MCS在乳糖启动子之下,按理说是可以转录的。
但要注意的一点是虽然乳糖启动子可以转录,但插入的序列在MCS中,而不是紧挨着启动子的,即可能会乱码,毕竟不一定是3个碱基的整数。
所以,就算转录了,也可能是乱码,故表现不出看阿霉素的抗性。
18楼2017-04-06 19:20:56
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