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我晴天一片

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因与载体连接转化后涂版长出了菌，提质粒却没有提出来，不知道什么原因？？

基因与载体PET-28a连接转化后涂板长出了菌，挑单克隆后摇试管提质粒却没有提出来，不知道什么原因？？是连接失败还是怎么回事？连接失败的原因是什么呢？
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1楼 2013-04-07 10:56:06
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回帖置顶 ( 共有1个 )

aeo22

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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我晴天一片(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-09 18:02:08
gyesang: 回帖置顶 2013-05-04 19:32:15
你转的感受态是什么菌种啊？
建议你摇完菌先闻一下菌的味道，如果是正常的大肠杆菌会有一股奶香味，如果是有一股让你想吐的恶臭味或者非大肠杆菌的怪味，就扔了吧。。。加溶液2不变澄清也扔了吧（大肠杆菌）。。。
如果抗生素失效，你会得到满板密密麻麻的菌，有质粒没质粒都长。。。
抽不出质粒，要么你抽的过程出问题；要么那个菌没有质粒的，杂菌；要么板上的菌正确，你摇菌培养污染了，摇起来的不是你要的菌，kana也非万能的。。。
要是自连长起来也是携带有质粒啊。。。
还是菌落PCR先鉴定吧
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11楼2013-04-09 01:20:41
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shangming

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。生物版块欢迎你的无私奉献。 2013-04-07 11:53:02
用的是amp抗性的话，培养12h左右长出来的才是抗性菌落，时间再长amp抗性就失效了，然后就会长出很多卫星菌落，这些卫星菌落基本上不含质粒，所以你在抗性培养基中培养长不出来。
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2楼2013-04-07 11:12:34
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★
我晴天一片(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-04 19:31:13
ls回答前至少看一下吧 pet28a的抗性是kan  没卫星菌落的
LZ可以的话先做个colony pcr预筛选下。
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4楼2013-04-07 11:23:00
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panyuzhu

禁虫 (小有名气)
★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-04 19:32:27
本帖内容被屏蔽
12楼2013-04-09 14:04:49
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普通回帖

留小保

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有可能连接失败有可能是提取质粒出问题
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人生若只如初见 何事秋风悲画扇
3楼2013-04-07 11:22:31
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Tporker

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
我晴天一片(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-04 19:31:24
可能是感受态污染了!建议你做个不加连接产物的阴性对照看看！
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值，夜渐浓，闻窗外蛙鸣，辗转无眠难入梦；此，风渐清，听庭内雨应，悱恻浮醒忆青笼。
5楼2013-04-07 12:25:35
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shangrila911

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
我晴天一片(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-04 19:31:34
首先确定 抗生素是否还有活性 还有 你提质粒过程操作是否有问题
操作都没错的话 建议用挑的单克隆菌液为模板进行pcr 预鉴定 是否是阳性克隆
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一切都会好的!
6楼2013-04-07 13:24:20
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我晴天一片

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shangming at 2013-04-07 11:12:34
用的是amp抗性的话，培养12h左右长出来的才是抗性菌落，时间再长amp抗性就失效了，然后就会长出很多卫星菌落，这些卫星菌落基本上不含质粒，所以你在抗性培养基中培养长不出来。

用的是卡纳的抗性，也有时间限制吗？
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7楼2013-04-07 13:28:30
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zc10052157

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
我晴天一片(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-04 19:31:43
你应该先做菌落PCR   有基因条带才抽质粒吧   很可能是污染菌
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hold住
8楼2013-04-07 20:28:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
我晴天一片(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-04 19:31:51
转化时最好做正负对照，保证抗性板、感受态都没有问题。先做下菌落PCR筛选一下也是不错的选择。此外，PET-28a的拷贝数不如一般克隆质粒高，提质粒的浓度会比较稀。
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9楼2013-04-08 00:58:25
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475502411

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
我晴天一片(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-04 19:31:59
28a是卡那抗性，一般不会长卫星菌落的，我想应该你杂菌，自连什么的
你重新做一下吧
双酶切后要泡脚回收，不要直接回收
应该没问题的
保证每一步的正确性
good luck
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
10楼2013-04-08 11:16:27
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