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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pECFP-C1 表达载体transform vector into dam- host and make fresh DNA如何操作
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

[求助] pECFP-C1 表达载体transform vector into dam- host and make fresh DNA如何操作

我PCR了一个基因，设计引物时选的下游酶切位点为Xba I,恰好欲连接的pECFP-C1 表达载体的这个酶切位点标记了※，标注为If you wish to digest the vectors with this enzyme,you will need to transform the vector into a dam- host and make fresh DNA.请问这是什么意思？应该如何操作？万分感谢！附件为我的表达载体说明书。
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  • 附件 1 : 真核表达载体PT3259-5.pdf
    • 2013-01-20 10:01:50, 47.89 K

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1楼 2013-01-20 10:02:37
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
谁能帮帮我？？
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2楼2013-01-20 10:19:50
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-22 11:04:07
就是你这个质粒如果是从DH5a的大肠杆菌菌株提出来的，XbaI这个位点会被甲基化，然后会酶切不开，要想获得没有甲基化的质粒，需将该质粒转入dam-的菌株中（就是DNA adenine methylase 敲除的菌株），比如JM110，然后再提取质粒做酶切。嫌麻烦就换换酶切位点吧
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2013-01-20 12:02:31
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gyesang at 2013-01-20 12:02:31
就是你这个质粒如果是从DH5a的大肠杆菌菌株提出来的，XbaI这个位点会被甲基化，然后会酶切不开，要想获得没有甲基化的质粒，需将该质粒转入dam-的菌株中（就是DNA adenine methylase 敲除的菌株），比如JM110，然后 ...

就是把我这个载体摇菌提质粒，直接加入到JM110感受态里，冰上静置，42度热激，冰上冷却，然后加LB培养基，37度摇，涂平板，挑单菌落，摇菌，提质粒，再酶切，就可以了吗？
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4楼2013-01-20 12:55:45
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by yuguiyan at 2013-01-20 12:55:45
就是把我这个载体摇菌提质粒，直接加入到JM110感受态里，冰上静置，42度热激，冰上冷却，然后加LB培养基，37度摇，涂平板，挑单菌落，摇菌，提质粒，再酶切，就可以了吗？...

是的，也就是转化到JM110后，然后摇菌提质粒，就能用XbaI酶切，JM110是个dam-的菌株
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5楼2013-01-20 19:42:27
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l_dot

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果这个酶切位点被甲基化，就切不动
dam- host 就是甲基化酶缺陷菌株

意思叫你先把载体转到dam- 宿主，再重新提质粒。新的质粒该位点就不会被甲基化
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6楼2013-01-20 21:35:05
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
6楼: Originally posted by l_dot at 2013-01-20 21:35:05
如果这个酶切位点被甲基化，就切不动
dam- host 就是甲基化酶缺陷菌株

意思叫你先把载体转到dam- 宿主，再重新提质粒。新的质粒该位点就不会被甲基化

就是把我这个载体摇菌提质粒，直接加入到JM110感受态里，冰上静置，42度热激，冰上冷却，然后加LB培养基，37度摇，涂平板，挑单菌落，摇菌，提质粒，再酶切，就可以了吗？...
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7楼2013-01-21 20:33:00
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
5楼: Originally posted by gyesang at 2013-01-20 19:42:27
是的，也就是转化到JM110后，然后摇菌提质粒，就能用XbaI酶切，JM110是个dam-的菌株...

多谢
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8楼2013-01-21 20:33:11
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柔时290

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主啊，你现在找到JM110菌株了吗？我也在找这个菌啊。。。到处找不到啊，买的话1000多，好贵啊，老板不给我买，让我找实验室借。。。找不到啊！！！好郁闷 你要是有这个菌株，能不能送我点啊？？？
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9楼2013-04-12 11:27:42
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 柔时290 at 2013-04-12 11:27:42
楼主啊，你现在找到JM110菌株了吗？我也在找这个菌啊。。。到处找不到啊，买的话1000多，好贵啊，老板不给我买，让我找实验室借。。。找不到啊！！！好郁闷 你要是有这个菌株，能不能送我点啊？？？

没有那么贵
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10楼2013-12-05 11:31:11
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