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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

[求助] pECFP-C1 表达载体transform vector into dam- host and make fresh DNA如何操作

我PCR了一个基因,设计引物时选的下游酶切位点为Xba I,恰好欲连接的pECFP-C1 表达载体的这个酶切位点标记了※,标注为If you wish to digest the vectors with this enzyme,you will need to transform the vector into a dam- host and make fresh DNA.请问这是什么意思?应该如何操作?万分感谢!附件为我的表达载体说明书。
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  • 2013-01-20 10:01:50, 47.89 K

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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

引用回帖:
6楼: Originally posted by l_dot at 2013-01-20 21:35:05
如果这个酶切位点被甲基化,就切不动
dam- host 就是甲基化酶缺陷菌株

意思叫你先把载体转到dam- 宿主,再重新提质粒。新的质粒该位点就不会被甲基化

就是把我这个载体摇菌提质粒,直接加入到JM110感受态里,冰上静置,42度热激,冰上冷却,然后加LB培养基,37度摇,涂平板,挑单菌落,摇菌,提质粒,再酶切,就可以了吗?...
7楼2013-01-21 20:33:00
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

谁能帮帮我??
2楼2013-01-20 10:19:50
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-22 11:04:07
就是你这个质粒如果是从DH5a的大肠杆菌菌株提出来的,XbaI这个位点会被甲基化,然后会酶切不开,要想获得没有甲基化的质粒,需将该质粒转入dam-的菌株中(就是DNA adenine methylase 敲除的菌株),比如JM110,然后再提取质粒做酶切。嫌麻烦就换换酶切位点吧
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2013-01-20 12:02:31
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

引用回帖:
3楼: Originally posted by gyesang at 2013-01-20 12:02:31
就是你这个质粒如果是从DH5a的大肠杆菌菌株提出来的,XbaI这个位点会被甲基化,然后会酶切不开,要想获得没有甲基化的质粒,需将该质粒转入dam-的菌株中(就是DNA adenine methylase 敲除的菌株),比如JM110,然后 ...

就是把我这个载体摇菌提质粒,直接加入到JM110感受态里,冰上静置,42度热激,冰上冷却,然后加LB培养基,37度摇,涂平板,挑单菌落,摇菌,提质粒,再酶切,就可以了吗?
4楼2013-01-20 12:55:45
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