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zd0017

铁虫 (小有名气)

[求助] 为什么扩了一个抗性基因,连到载体上,这个基因没有表达呢,跪求各个大牛指导!!!

最近从载体pEGFP-C3上扩neo基因,再连到pMD18-T载体上,但没有neo抗性,请大牛指导下哪里出了问题,经测序,没有突变!!!小菜一枚在这里先谢谢各位牛人啦!!!
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zd0017

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-23 13:03:15
会不会是连接转化的问题?...

转化时分别涂了amp、kana、neo抗性的板个一个,只有amp的长出了克隆,送去测序结果是正确的,但是就是没有表达kana/neo抗性,如果这一步不行的话,我下面要构建载体做敲除岂不是也不行了!!
7楼2013-05-23 13:35:40
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查看全部 18 个回答

酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
zd0017(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-22 21:58:12
pEGFP-C3是个真核表达载体,pMD18-T是个原核载体吧?真核和原核的表达调控元件是完全不同的。
2楼2013-05-22 21:16:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
zd0017(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-24 03:08:50
gyesang: 回帖置顶 2013-05-24 03:08:58
新霉素抗性基因是真核表达载体的一种筛选marker,neo基因编码新霉素磷酸转移酶,通过对G418、新霉素和卡那霉素磷酸化来降解抗生素儿实验抗性的。在原核生物宿主里应该用卡那霉素筛选。
3楼2013-05-23 02:45:49
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zd0017

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-23 02:45:49
新霉素抗性基因是真核表达载体的一种筛选marker,neo基因编码新霉素磷酸转移酶,通过对G418、新霉素和卡那霉素磷酸化来降解抗生素儿实验抗性的。在原核生物宿主里应该用卡那霉素筛选。

谢谢你的回复,也用了kana抗性的筛了,也没克隆长出啊,不知道什么原因啊
4楼2013-05-23 11:22:41
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