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林默泪

新虫 (初入文坛)

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[求助] 克隆转化，转化子就是不含目的基因。

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1楼 2013-11-04 16:16:11

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kennyhas

铜虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
林默泪: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-11-06 19:24:07
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-01-27 19:51:56

我的目的基因是750bp，质粒载体是PET-24a。
我从我师兄的菌提取质粒，然后用KOD酶PCR目的基因。
然后两步酶切质粒和目的基因。NdeI酶切，胶回收，再BamHI酶切，再回收。酶切时间是3个小时以上。
提质粒、PCR、回收后都有电泳检测，条带位置正确。
然后用东洋纺的高效链接液链接目的基因和质粒的酶切片段。连接时间大概时2个小时以上。
转化到感受态细胞JM109，热击法。
然后培养在含Kan+的平板上。
第一次没有长，第二次4个平板，只有一个平板上长了3个，第三次，4个平板上都有，每个大约3—5个。
PCR检测，都没有P出目的片段

从你描述来看,pET载体应该是双酶切完全了.(但是一般情况下要注意载体上两个酶切位点之间的片段有多长?胶回收的时候有没有看到切出来的片段? 如果载体没切干净,那可能会长出很多载体自连的假克隆.)
你的问题很可能出在PCR产物的酶切. 首先,你的引物5'端加了保护碱基吗?如果没有,酶切会变得相对困难.
第二,BamHI 不太好切, 而且你的酶切时间是3小时左右,所以很可能PCR产物上的BamHI没切动或者效率很低.
有一个麻烦点的办法是,你先把PCR产物连接到T-载体上,(如果没有T-载体,随便找个载体,,酶切,补平然后去磷,PCR产物加磷,用平末端连接),然后再从T-载体上把你的目的基因用NdeI和BamHI 切下来,这样做你就能确定目的基因的两端肯定是切开了的. 如果还长不出克隆,那就不是酶切,连接的问题了(当然,你要确定你的感受态细胞是正常的)