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林默泪

新虫 (初入文坛)

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[求助] 克隆转化，转化子就是不含目的基因。

我的目的基因是750bp，质粒载体是PET-24a。
我从我师兄的菌提取质粒，然后用KOD酶PCR目的基因。
然后两步酶切质粒和目的基因。NdeI酶切，胶回收，再BamHI酶切，再回收。酶切时间是3个小时以上。
提质粒、PCR、回收后都有电泳检测，条带位置正确。
然后用东洋纺的高效链接液链接目的基因和质粒的酶切片段。连接时间大概时2个小时以上。
转化到感受态细胞JM109，热击法。
然后培养在含Kan+的平板上。
第一次没有长，第二次4个平板，只有一个平板上长了3个，第三次，4个平板上都有，每个大约3—5个。
PCR检测，都没有P出目的片段。

想请教下各位大神，大概会是什么问题，那些地方需要改进。

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1楼 2013-11-04 16:16:11

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林默泪

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引用回帖:

7楼: Originally posted by kennyhas at 2013-11-06 17:24:24
我的目的基因是750bp，质粒载体是PET-24a。
我从我师兄的菌提取质粒，然后用KOD酶PCR目的基因。
然后两步酶切质粒和目的基因。NdeI酶切，胶回收，再BamHI酶切，再回收。酶切时间是3个小时以上。
提质粒、PCR、回 ...

恩，一般其实我第二步BamHI酶切都是过夜切的。
引物设计是带上保护碱基的。
两个酶切位点之间大概只有40bp的碱基，所以其实我也不是很确定。
我下次有时间再试试TA克隆。
非常感谢你的解答。