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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 感受态转化及阳性克隆出现问题
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银小耳

金虫 (小有名气)

[交流] 感受态转化及阳性克隆出现问题 已有6人参与

大肠杆菌DH5a感受态转化
1、从-70℃冰箱中取感受态细胞悬液,冰上解冻5min。
2、 加入连接产物10μl (含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻弹匀,冰上放置30min。
3、42℃水浴中热击90秒,热击后迅速置于冰上冷却3min。
4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃,100r/min摇床培养1h,使细菌恢复正常生长状态
5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于LB平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。
PCR验证阳性克隆
1.使用无菌白枪头将转化后长出的白色单菌落点种转移到含有氨苄青霉素的平板上，37℃过夜培养
2.挑取氨苄平板上的单菌落到含氨苄的LB液体培养基中，180rpm/min，37℃摇床培养3h
3.取2ml菌液作为PCR模板，PCR反应引物为T载体通用引物：RV-M和M13-17
4.PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，排除部分假阳性克隆片段

实验每次都是卡在PCR验证阳性克隆的第二步，37度摇床培养3h后培养基都很澄清，基本没有菌长出来，之前条白色单菌落到含氨苄的LB液体培养基中时，明显可以看到菌落接进去了呀，求大神帮帮忙看到底是哪里出了差错？？
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1楼 2014-04-18 16:10:16
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Neo2000

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
直接PCR检测试试，那个菌浓度不会太高

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2014-04-18 17:55:58
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bestzdz

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1??2?????????????????????????????????????ǹ?????????????

[ ????????? http://muchong.com/3g ]
赞一下(1人) 回复此楼
学海无涯，乐在其中；谨言慎行，惜时自勉！
2楼2014-04-18 17:50:23
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kueradi

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-19 13:36:09
第一个的5.和第二个的1.是重复吗？   5做完了直接挑克隆（含氨苄的平板），在液体氨苄培养基中摇即可，然后取1ul作为PCR模版即可。在氨苄固体平板中可以长出，而液体氨苄中不可以，那么是否你的固体平板中的氨苄失活？长出的是杂菌？
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4楼2014-04-18 20:09:06
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lairongpeng

银虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-19 13:36:18
摇菌3h本来就看不出来，但是菌液PCR是有结果的。建议您转化涂平板过夜，第二天长出来的单菌落直接接种到含有amp的1ml离心管中，37摄氏度150rpm，3h后取2ul PCR，阳性的话直接把离心管中剩下的菌液，一半用甘油保菌，一半送去测序。速度快，单克隆的概率高！
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5楼2014-04-18 20:50:23
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