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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆方面的问题
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wangdongadd

新虫 (小有名气)

[求助] 克隆方面的问题

我的样品先经过DGGE然后切胶回收，后用试剂盒进行了纯化，请问在做克隆连接时还需要加A吗？16度连接过夜可以吗？做阳性质粒对照和阴性对照时也需要连接这一步吗？还是转化的时候再在感受态加入质粒和无菌水？加多少呢？谢谢！
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1楼 2013-07-25 21:33:24
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wangdongadd(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩，gy版热心肠 2013-07-26 08:54:58
1. 你连的是什么载体，T载体还是T-blunt载体，如果是T载体，回收产物需不需要加A，取决于你用的什么类型DNA聚合酶，如果是高保真酶，那就需要加A，如果是Taq酶扩增的，就不需要再加A

2. 普通的T4 DNA Ligase一般需要16度连接过夜

3. 阳性质粒转化，主要是验证感受态细胞，平板抗性，阴性对照主要是验证载体自连，T载体用不着阴性对照
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-07-25 22:51:05
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wangdongadd

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-07-25 22:51:05
1. 你连的是什么载体，T载体还是T-blunt载体，如果是T载体，回收产物需不需要加A，取决于你用的什么类型DNA聚合酶，如果是高保真酶，那就需要加A，如果是Taq酶扩增的，就不需要再加A

2. 普通的T4 DNA Ligase一般 ...

太到位了，谢谢。
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3楼2013-07-26 14:42:00
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
链接酶的话也可以考虑4度连，因为它比较容易失活，16度有危险
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我会绕一个圈，走回到实验室
4楼2013-07-26 15:13:40
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