应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 阳性克隆的鉴定问题
71/1返回列表
查看: 3276  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

zqt123_1981

木虫 (小有名气)

[交流] 阳性克隆的鉴定问题 已有6人参与

各位如图1蓝白斑筛选白斑菌落PCR很正确，然后摇菌提取质粒，图2前10个孔质粒PCR，后十个孔质粒酶切。图三 前十个孔质粒酶切后十个孔是质粒
为啥PCR有目的条带，酶切却没有啊






[ Last edited by zqt123_1981 on 2011-6-2 at 19:45 ]
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-06-01 21:20:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+3): good 2011-06-02 09:05:49
引用回帖:
Originally posted by zqt123_1981 at 2011-06-01 21:20:19:
各位我有一段未知片段要去测序，在蓝白斑筛选的时候白斑用菌落PCR鉴定结果正确，然后挑菌进行摇菌培养，我看有的说菌液也可以PCR，菌液提取质粒也可以PCR，还有就是质粒酶切。这三个哪个更准确一点，如果酶切的 ...

PCR的话，用菌落、菌液或者质粒来做都可以，但是用菌落和菌液来鉴定是最快速的方法，一般如果pcr的方法鉴定不出来的话就采用酶切来验证，酶切位点的选择只要在克隆位点的的上下游随便选两个就可以了，当然考虑到成本，越常用的酶越好。
赞一下(2人) 回复此楼
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
2楼2011-06-01 22:12:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangby2002

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+3): good 2011-06-02 09:06:13
引用回帖:
Originally posted by zqt123_1981 at 2011-06-01 21:20:19:
各位我有一段未知片段要去测序，在蓝白斑筛选的时候白斑用菌落PCR鉴定结果正确，然后挑菌进行摇菌培养，我看有的说菌液也可以PCR，菌液提取质粒也可以PCR，还有就是质粒酶切。这三个哪个更准确一点，如果酶切的 ...

菌落PCR,质粒PCR,双酶切鉴定我都做过，这三种都是鉴定阳性克隆的。根据自己实验室的情况来定吧，双酶切鉴定成本很高，看你用的载体来定吧，有的载体图上没双酶切位点，根据载体上的protol来定吧
赞一下(2人) 回复此楼
业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。
3楼2011-06-01 22:30:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

d1emon

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+2): good 2011-06-02 09:06:23
酶切最准确，在用菌液pcr的基础上再进行双酶切，结果可信度最高
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2011-06-02 06:09:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

triger2011

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+2): good 2011-06-02 09:06:37
引用回帖:
Originally posted by zqt123_1981 at 2011-06-01 21:20:19:
各位我有一段未知片段要去测序，在蓝白斑筛选的时候白斑用菌落PCR鉴定结果正确，然后挑菌进行摇菌培养，我看有的说菌液也可以PCR，菌液提取质粒也可以PCR，还有就是质粒酶切。这三个哪个更准确一点，如果酶切的 ...

酶切。

如果是单酶切，就选基因上有，但是载体上没有的位点。

双酶切，就选基因片段两端设计的酶切位点，但在载体上没有的位点。
赞一下(2人) 回复此楼
努力改变自己！
5楼2011-06-02 07:42:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yabxxh

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+2): good 2011-06-02 18:48:52
本人现在已经放弃PCR鉴定了，直接摇菌，提取质粒，双酶切鉴定。
什么蓝白斑，PCR鉴定都是浮云，呵呵。
因为我用的聚合酶太贵了，相比之下，酶切要快速、省事和经济得多。
鉴于你的载体，建议用salI和NocI来双酶切，当然也可以用你片段两端的酶切位点来切
赞一下(3人) 回复此楼
6楼2011-06-02 09:44:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
1949stone(EPI+1): 来也 2011-06-02 14:54:17
PCR验证是初步筛选，就是看你的目的基因是否已经连接到载体上了；包括用划到平板上的菌当模板进行PCR，或者用摇的菌液直接当模板进行PCR，如果能够扩增出目的片段，就说明你很有可能是连接正确了；

其次确定了这个菌有可能对的话，那么直接提质粒，酶切验证，至于楼主说的载体没用过，但是你连接之前用什么酶切的，现在重组质粒依然用什么酶进行切，我有点诧异，楼主难道不知道吗？

酶切完之后，点样，对照就是你当初酶切的基因，酶切的载体，然后就是你现在酶切的重组载体，如果大小正确，那么就OK了。。。继续下游工作吧！
赞一下(6人) 回复此楼
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
7楼2011-06-02 14:50:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 zqt123_1981 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 283求调剂 +8 小楼。 2026-03-12 11/550 2026-03-16 09:46 by 无际的草原
[考研] 调剂 +8 调剂的考研学生 2026-03-09 8/400 2026-03-15 22:14 by Winj1e
[考研] 材料专硕326求调剂 +4 墨煜姒莘 2026-03-15 4/200 2026-03-15 11:02 by dyw
[考研] 085601材料工程315分求调剂 +3 yang_0104 2026-03-15 3/150 2026-03-15 10:58 by peike
[考研] 289求调剂 +5 步川酷紫123 2026-03-11 5/250 2026-03-15 00:45 by kruisytel
[考研] 265求调剂 +4 威化饼07 2026-03-12 4/200 2026-03-14 17:23 by userper
[考研] 材料080500调剂求收留 +3 一颗meteor 2026-03-13 3/150 2026-03-14 10:54 by peike
[考研] 318求调剂 +3 李新光 2026-03-10 3/150 2026-03-14 00:21 by JourneyLucky
[考研] 311求调剂 +8 zchqwer 2026-03-10 8/400 2026-03-14 00:01 by JourneyLucky
[考研] 285 求调剂 资源与环境 一志愿北京化工大学 +3 未名考生 2026-03-10 3/150 2026-03-13 23:04 by JourneyLucky
[考研] 材料专硕288分求调剂 一志愿211 +4 在家想你 2026-03-11 4/200 2026-03-13 22:49 by JourneyLucky
[考研] 一志愿中科院，化学方向，295求调剂 +4 一氧二氮 2026-03-11 4/200 2026-03-13 22:35 by JourneyLucky
[考研] 293求调剂 +3 世界首富 2026-03-11 3/150 2026-03-13 16:27 by JourneyLucky
[考研] 考研调剂 +4 芬达46 2026-03-12 4/200 2026-03-13 16:04 by ruiyingmiao
[考研] 工科278分求调剂 +5 周慢热啊 2026-03-12 7/350 2026-03-13 15:49 by JourneyLucky
[考研] 工科材料085601 279求调剂 +8 困于星晨 2026-03-12 10/500 2026-03-13 15:42 by ms629
[论文投稿] 投稿问题 5+4 星光灿烂xt 2026-03-12 6/300 2026-03-13 14:17 by god_tian
[考研] 321求调剂（食品/专硕） +3 xc321 2026-03-12 6/300 2026-03-13 08:45 by xc321
[考研] 420求调剂 +4 莫向外求11 2026-03-10 6/300 2026-03-12 14:41 by ruiyingmiao
[考研] 085600 材料与化工 295 求调剂 +10 dream…… 2026-03-10 12/600 2026-03-12 13:46 by dream……
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭