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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 阳性克隆的鉴定问题
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zqt123_1981

木虫 (小有名气)

[交流] 阳性克隆的鉴定问题已有6人参与

各位如图1蓝白斑筛选白斑菌落PCR很正确，然后摇菌提取质粒，图2前10个孔质粒PCR，后十个孔质粒酶切。图三 前十个孔质粒酶切后十个孔是质粒
为啥PCR有目的条带，酶切却没有啊






[ Last edited by zqt123_1981 on 2011-6-2 at 19:45 ]
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1楼2011-06-01 21:20:19
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
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dhd997(金币+3): good 2011-06-02 09:05:49
引用回帖:
Originally posted by zqt123_1981 at 2011-06-01 21:20:19:
各位我有一段未知片段要去测序，在蓝白斑筛选的时候白斑用菌落PCR鉴定结果正确，然后挑菌进行摇菌培养，我看有的说菌液也可以PCR，菌液提取质粒也可以PCR，还有就是质粒酶切。这三个哪个更准确一点，如果酶切的 ...

PCR的话，用菌落、菌液或者质粒来做都可以，但是用菌落和菌液来鉴定是最快速的方法，一般如果pcr的方法鉴定不出来的话就采用酶切来验证，酶切位点的选择只要在克隆位点的的上下游随便选两个就可以了，当然考虑到成本，越常用的酶越好。
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
2楼2011-06-01 22:12:42
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zhangby2002

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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dhd997(金币+3): good 2011-06-02 09:06:13
引用回帖:
Originally posted by zqt123_1981 at 2011-06-01 21:20:19:
各位我有一段未知片段要去测序，在蓝白斑筛选的时候白斑用菌落PCR鉴定结果正确，然后挑菌进行摇菌培养，我看有的说菌液也可以PCR，菌液提取质粒也可以PCR，还有就是质粒酶切。这三个哪个更准确一点，如果酶切的 ...

菌落PCR,质粒PCR,双酶切鉴定我都做过，这三种都是鉴定阳性克隆的。根据自己实验室的情况来定吧，双酶切鉴定成本很高，看你用的载体来定吧，有的载体图上没双酶切位点，根据载体上的protol来定吧
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业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。
3楼2011-06-01 22:30:55
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d1emon

铜虫 (初入文坛)
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dhd997(金币+2): good 2011-06-02 09:06:23
酶切最准确，在用菌液pcr的基础上再进行双酶切，结果可信度最高
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4楼2011-06-02 06:09:06
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triger2011

木虫 (正式写手)
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dhd997(金币+2): good 2011-06-02 09:06:37
引用回帖:
Originally posted by zqt123_1981 at 2011-06-01 21:20:19:
各位我有一段未知片段要去测序，在蓝白斑筛选的时候白斑用菌落PCR鉴定结果正确，然后挑菌进行摇菌培养，我看有的说菌液也可以PCR，菌液提取质粒也可以PCR，还有就是质粒酶切。这三个哪个更准确一点，如果酶切的 ...

酶切。

如果是单酶切，就选基因上有，但是载体上没有的位点。

双酶切，就选基因片段两端设计的酶切位点，但在载体上没有的位点。
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努力改变自己！
5楼2011-06-02 07:42:14
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yabxxh

木虫 (正式写手)
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dhd997(金币+2): good 2011-06-02 18:48:52
本人现在已经放弃PCR鉴定了，直接摇菌，提取质粒，双酶切鉴定。
什么蓝白斑，PCR鉴定都是浮云，呵呵。
因为我用的聚合酶太贵了，相比之下，酶切要快速、省事和经济得多。
鉴于你的载体，建议用salI和NocI来双酶切，当然也可以用你片段两端的酶切位点来切
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6楼2011-06-02 09:44:44
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★
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1949stone(EPI+1): 来也 2011-06-02 14:54:17
PCR验证是初步筛选，就是看你的目的基因是否已经连接到载体上了；包括用划到平板上的菌当模板进行PCR，或者用摇的菌液直接当模板进行PCR，如果能够扩增出目的片段，就说明你很有可能是连接正确了；

其次确定了这个菌有可能对的话，那么直接提质粒，酶切验证，至于楼主说的载体没用过，但是你连接之前用什么酶切的，现在重组质粒依然用什么酶进行切，我有点诧异，楼主难道不知道吗？

酶切完之后，点样，对照就是你当初酶切的基因，酶切的载体，然后就是你现在酶切的重组载体，如果大小正确，那么就OK了。。。继续下游工作吧！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
7楼2011-06-02 14:50:10
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